157208. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hálós kallikrein-inhibitor előállítására
157208 A táblázat Molekulanagyság tripszm Kallikreinhatás . ®átlás KIE/mg KIE/mg Antifilbri- Véralvadásgátló hatás nolitikus a) trombopíasztin-idő hatás b) rekalcifikalódási idő KIE/mg KIE/mg Kalleikrein A kaUikrein-inihilbitar inhibitor szukcinimidoil-származéfca Tetramer — hexamer Trim er 830 555 Dimer Monomer Változatlan 841 853 1780 1343 3120 2605 7000 7000 488 352 1384 3117 7000 a) 1.1060 b) 7456 a) 4044 b) 3383 a) 4934 b) , 4392-a) 5586 b) 5078 a) 7000 b) 7000 ecetsav; pH = 7,5. Az eluálás sebessége kb. 60 25 térfogatra bepároljuk, ioncserélő oszlopon sóml/óra. mentesítjük és fagyasztva szárítjuk. A nagyobb molekulájú reakciótermékek, a trimarek, dimerek és monomerek egymást kö- A különböző tripszin-komplex frakciók kitervelve hagyják el az oszlopot. melését és disszociációs állandóját (Ki) a B. Az egyes frakciókat vákuumban kib. 10 ml 3 Q táblázatban adjuk meg. B. táblázat Frakció száma mg Kitermelés % Körülbelüli molekulasúly {gélszűréssel) Ki I 37,1 7,1 II 47,7 9,2 III 86,2 16,5 IV 122,1 23,4 2. példa: 4,0 g (0,62 mmól) kallikrein-inhibitor 200 45 ml foszfátpuff erben (pH = 10,5) oldunk. Az oldathoz szobahőmérsékleten állandó keverés mellett, egy óra alatt 404 mg (1,85 mmól) borostyánk ősav^diiminometiléter-hidrokloridot adunk. Ezalatt az oldat pH-ját 2n nátriumhidr- 50 oxid-oldat adagolásával 10,5 értékben tartjuk. Az elegyet még egy órán át keverjük, majd az oldat pH-ját 2n sósavval 7-re állítjuk és G 3-as üvegszűrőn átszűrve kis mennyiségű csapadékot választunk el. A csapadékot kevés vízzel 55 massuk. Az egyesített szűrleteket vákuumban kb. 80 miire bepároljuk. A szűrlet tripszinre vonatkoztatott gátló kapacitása 4000 U, azaz a felhasznált inhibitor gátló kapacitásának 27 %-a. 60 Az egyesített szűrletet 9,0 x 90 cm méretű, Sephadex G 50R (előállító: Pharmacia Fine Chemicals Uppsala, Svédország) dextrángél töltettel ellátott, 0,05 M ammóniumacetáttal pH = W 4,7-re beállított oszlopon kromatografáljuk. g5 37—58 000 (oliigiomerek) 21000 (trimerök) 10 000 (dimerek) 6 000 (monomerek) 2,5-10-0,8-10~ 0,9-10" 1,3-10" így a monomer és dimer frakciókat elválasztjuk. A nagymolekulájú frakciókat egyesítjük, fagyasztva szárítjuk és dextrángéllel (Sephadex G 100^) töltött oszlopon újra kromatografáljuk. Azokat a frakciókat, -amelyek a gélfrakcionálás alapján 30 000-nél nagyobb molekulasúllyal rendelkeznek, egyesítjük és fagyasztva szárítjuk. A gélfrakcionálás utáni átlagos molekulasúly 100 000 körüli érték. Kitermelés: 1,26 g. Az így előállított termék az alábbi farmakológiai tulajdonságokkal rendelkezik: Tripszingátló hatás: (benzoilarginin-p-nitroanil'id szubsztrátummal végzett próba) 0,65 U/mg. Ez az érték 1000 KIE/mg-nek felel meg, azaz a kallikrein-inhibitor hatásának 14%-a. Rekalcifikalódási idő (patkányplazmán)': 72 800 KIE/mg (a kallikrein-inhibitor hatásánál 10,4-szer erősebb). Trombaplasztin^idő (marhaplazmán): 46 900 KIE/mg (a kallikrein-inhibitor hatásánál 6,7-szer erősebb). 2
