157108. lajstromszámú szabadalom • Eljárás celluláz- és hemicelluláz-aktivítású enzimkomplex kinyerésére fermentációs anyagból

3 157108 4 eljárás épp oly általános jellegű, es egyéb fer-, mentációs enzimek előállítására is használatos, mint a szerves oldószeres kicsapás. Ennek egyik ismert kivitelezési módja szerint a szűrt fermentlét kíméletesen betárolják, majd hideg 5 acetonnal kicsapják [B. C. Sison, jr. és mt: Arch. Biochem. Biophys., 75, 260—272 (1958)]. Ugyanezen megoldás variációját jelenti, midőn a szárított micélium tömeg híg savas kivonatából alkohol hozzáadásával csapják ki a cellu- 10 lázt (3,251,750 sz. japán szabadalom). Kicsapásos enzimkoncentrálás valósul meg akkor is, mikor tannin hozzáadásával választják ki az enzimet oldatából (G. Pettersson, J. Porath: Methods in Enzymology, VIII, 603—607, 1966. 15 Acad. Press. New York—London). Ezek az eljárások a fermentlé enzimjeit töményítik, és a kicsapás jellegétől függően egyben bizonyos fokú tisztulást is eredményeznek főleg a kis molekulájú anyagoktól. Hátrányuk 20 azonban-, hogy az iparban szereplő nagy térfogatok miatt komoly kicsapószer-igénnyel lépnek fel, vagy ezt elkerülendő, a fermentációs anyag előzetes bepárlását teszik szükségessé. Az így nyert termék aktivitása a kísérő makro- 25 molekuláris szennyezések tömege miatt rendszerint alacsony, és a termékek többségének oldhatósága is tökéletlen. Joggal merül fel tehát az igény nagyobb tisztaságú cellulolitikus enzim előállítására; az idevonatkozó szakiroda- 30 lomból azonban általában olyan módszerek ismeretesek, amelyek inkább tudományos jelentőségűek, ipari szempontból nem kivitelezhetőek gazdaságosan. A tisztításnak legegyszerűbben kivitelezhető 35 módja a szerves oldószeres kicsapással kapott termék feloldása és szűkített koncentráció-határok között végzett újbóli kicsapása (Nobuo Toyama: Meicelase, Pract. Appl. No. 1). Egy. másik megoldás szerint az ammonszulfátos ki- 40 csapással nyert anyag szennyezéseit akridin származékkal, például Rivanoílal eltávolítják és az enzimtartalmú oldatot az említett sóval ismételten kicsapják [Nobuo Toyama: Memoirs of Faculty of Agriculture, 3, 100—138 (I960)]. 45 A „nyers" cellulolitikus enzimkészítmények nagyfokú szennyezettségére utal az a megfigyelés is, hogy jelentős tisztulás érhető el az enzim vizes oldatának egyszerű dialízisével is [Gentaro Okada és mt: J. Ferm. Techn., 44, 682—690 50 (1966)]. A legújabb eljárások összetett és inkább laboratóriumi szinten kivitelezhető cellulózalapú ioncserélők (DEÁE-, ill. CM-cellulóz) felhasználására épülő tisztítási műveleteket alkalmaznak, de gyakran gélszűrési műveletekhez 55 is folyamodnak [G. Pettersson, J. Porath: Methods in Enzymology, VIIÍ. 603—ŐO?, 1966. Acad. Press. New York—London; Kiyoshi Nara és mt: J. Ferm. Tech., 43, 653—660 (1965)]. Az utóbbi módszerekkel a fajlagos aktivitás- 60 ban mindössze 4—8-szoros aktivitás-növekedést jelentő tisztulást tudtak elérni. A találmány alapja az a felismerés, hogy fermentációs anyagokból a cellulolitikus enzimek betöményítése adszorpcióval is lehetséges, még- gs pedig vízben és szerves oldószerekben egyaránt oldhatatlan, szilikát-alapú adszorbensnek (nátrium-alumínium-magnézium-szilikát, kaolin, azbeszt, diatóma föld, bentonit, derítőföld) felhasználásával. Vizsgálataink során ugyanis azt találtuk, hogy az említett adszorbensek az enzimet savanyú vegyhatás mellett — az enzim izoelektromos pontja alatt — reverzibilisen megkötik. Ez a felismerés azért meglepő, mert nem volt várható, hogy a cellulolitikus enzimek az enzimaktivitás jelentős csökkenése nélkül adszorbeálódnak az említett felületeken. Nem kevésbé meglepő, hogy ez a jelenség olyan vegyhatás mellett következik be, ahol a cellulolitikus enzimek labilisak és gyorsan inaktivalódnak; ismeretes ugyanis, hogy ezen enzimek működésének pH- és stabilitás-optimuma 4,5 és 6 pH között jelentkezik [B. B. Sison, Jr. és mt: Arch. Biochem. Biophys., 75, 260—272 (1958)]. Az abszorbens jelenléte az enzimet stabilizálni képes: pl. az Aspergillus species fermentlé 50 °C-on aktivitásának 42%-át elveszti 30 perc alatt, ezzel szemben 1% derítőföld'jelenlétében csak 28%-át. A megkötött cellulolitikus enzimek újbóli oldatba vitelével kapcsolatos kíséi léteink ugyancsak meglepő felismeréshez vezettek. Azt találtuk, hogy számottevő enzimaktivitást sem ismételt vizes eluciót, sem a közeg lúgosítását követően nem lehetett kimutatni az oldatban. Ezzel szemben sók vizes oldatának alkalmazásával — különösen az adszorpció vegyhatását meghaladó pH értékek mellett — a megkötött enzim jelentős része, az alkalmazott sók minőségétől és koncentrációjától függően, oldatba vihető lett. Az I. táblázatból látható, hogy kationok közül az alkálifémek ionjai, az anionok közül pedig a klorid, szulfát, foszfát, továbbá foimiát és acetát hozzáadása a leoldás hatásfokát előnyösen befolyásolja. Legnagyobb fokú tisztítást azonban meglepő módon úgy sikerült elérni, ha a vizes sóoldathoz valamely alifás vagy heterociklikus nitrogéntartalmú bázis pl. trietilamin vagy piridin vagy kollidin vizes oldatát is adtuk, amely különben önállóan alkalmazva az enzim leoldását nem segítette elő. I. táblázat Eluáló szer MolapH Termelés ritás a megkötött anyag %-ában Deszt. víz 5 0,6 Ammónia 7,5 3 Na acetát-ecetsav 0,1 5 10 Na acetát-ecetsav 0,05 5,9 5 Na acetát-ecetsav 0,1 5,9 22 Na acetát-ecetsav 1,0 5,9 34 Na formiát 3,0 5,9 27 Na acetát-ecetsav 1,0 6,5 80 Na klorid 1,0 5,9 10 Ammonszulfát 1,0 5,9 6 Ammonacetát 1,0 5,9 8 3