156574. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a G-252 antibiotikum előállítására és kinyerésére
9 156574 10 A G---252 antibiotikum kinyerése. AG—252 hatóanyag kinyerése a maximális antifungális titert elért ferment-folyadékfoól történik. Ehhez a fermentlevet oxálsawal pH 3,5—4,0 értékig savanyítjuk meg, majd a micéliumot kiszűrjük. Az antifungális hatóanyag a micéliumhoz kötve marad. Kinyerésére a hasonló típusú antibiotikumoknál szokásos Cj—C5 alifás alkoholos — elsősorban butanolos —vagy acetonos extrakciónál előnyösebben alkalmazható egy megfelelően választott összetételű oldószerelegy. A vizes alkoholok ugyanis a G— 252 antibiotikumra csak korlátozott oldólhatásit fejtenek ki. Szerves 'bázisok, úm. piridin, kolüdin, ill. ezek homológjai lényegesen nagyobb oldóképességet mutatnak. Extrahálószerként való alkalmazásuk azonban .mégsem előnyös, mivel egyidejűleg jelentős mennyiségű szenynyező fehérjét és pigmentanyagot is oldanak. Felismerésünk szerint e káros mellékhatások minimálisra csökkenthetők,1 ugyanakkor igen nagy mértékű . oldóképesség érhető el C3—H-, alkoholokból, szerves bázisból és vízből álló oldószerejeggyel, melyben a bázikus komponens térfogataránya 5—40%, a vízé pedig 5—20%-ot tesz. ki. A többi között így előnyösen alkalmazható n^butanol, piridin és víz 70 : 15 : 15 arányú elegye. Az extrakt vákuum-bepárlásakor a víz és a bázikus komponens a desztillátumba kerül. Az extraktum anorganikus és színező-anyagoktól jelentős mértékben megtisztítható, az 1/5-ére bepárolt extraktum 1/20 térfogatnyi vízzel történő kikeverése útján. A G—252 hatóanyag a végső 1/10 térfogatra bepárolt, csak alkoholt tartalmazó oldatból hűtés hatására válik ki. A kiszűrt termék butanollal és acetonnal történt kimosás után farmakológiai alkalmazásra kellő tisztaságban áll rendelkezésre. A G—252 antibiotikum alkálisó képzése. Az előbb leírt módon nyert szabad savból felismerésünk szerint igen jó hatásfokkal és vízben legalább 10%-ban oldódó alkálisó (nátrium-, illetve kálium só) állítható elő, ha az alkálisó-képzést abszolút metilalkoholos közegben alkáli-alkoholátokkal és/vagy alkálihidroxidokkal végezzük, majd a feldolgozás további szakaszában fokozatos átmenetet biztosítunk a vizes közegre való áttéréshez úgy, hogy a G— 252 alkálisó metilalkoholos oldatát butanollal és vízzel elegyítjük, hogy még homogén oldatot kapjunk, majd ezen oldószer elegy vákuum-desztillációjával folyamatosan váltunk át a vizes közegre. Az ilyen desztillációval nyert, legalább 10'%-os vizes oldatban levő G—252 alkálisót szilárd termékként 10—20-szoros fölöslegű száraz butanolíban való szuszpendálással nyerjük ki. A G—252 antibiotikum szabad sav stabil vízoldható kolloid^formájának előállítása. Az előzők szerint kapott G—25:2 alkáli só 10 %-os vizes oldatából kiindulva felismerésünk szerint gélszűrő oszlopokon (pl. Seplhadex G— —25) való átbocsátás során az alkáli só vizes oldatának hidrolízise és a szabaddá vált alkálihidroxidtól való elkülönülése figyelhető meg, a G—252 antibiotikum szabad sav vizes kolloid oldat előállítása szokványos kivitelű, gélszűrő anyaggal töltött oszlopon való átáramol-K tatással történhet, mikoris a G—252 kolloid vizes oldata elöírakcióként az ún. kizárási térfogatban nyerhető, míg a további frakciókból csekély mennyiségű monomer G—252 nátriumsó, illetve az alkálihidroxidok különíthetők el. Az így nyert G—252 antibiotikum oldata valódi kolloid oldat, és vagy közvetlenül felhasználható, vagy porampullába töltve, fagyasztva szárítással, korlátlanul tárolhatóvá válik. K Példák: 0 1. példa: A Streptomyces G—252 nsp. spóráit 1 literes Q Blake üvegben 45 percen át 1.2 atü-n sterilizált, majd lehűlés után megszilárdult alábbi összetételű táptalajra szélesztettük: szójaliszt 2,0 0/0 glükóz 1,0 % Na2 HP0 4 0,5 % KH2 P0 4 0,05 % MgS04 0,005% agar 3,0 0/0 pH sterilizálás előtt 5,0. A tenyészetet 24 C°-on inkubáltuk. A fenti táptalajon ezen a hőmérsékleten az előbb kifejlődő, krémsárgás spórázó telepek mellett a 35 később kifejlődő, fehéren spórázó, süllyesztett kultúrában, gyenge termelőképességű utódokat létrehozó telepek kinövését azzal kerültük el, hogy a krémsárga színű spórák megjelenésekor a tenyészetet 0 C°-os helyiségbe, tárolás céljá-40 ból áthelyeztük. 2. példa: Az 1. példában leírt módon készített spórá-45 kat lemossuk, majd ezekből 4,3 x 1010 mennyiségűt 1000 liter űrtartalmú fermentorban 60 percen át 1.0 atü-n sterilizált, majd lehűtött 400 liter, alábbi összetételű tápfolyadékba oltottuk : 50 szójaliszt 2,0 % szacharóz 2,0 % kukoricalekvár 0,25% CaCOj 0,2 % ,. 55. NaCl 0,4 % pH sterilizálás előtt 5,0, sterilizálás után 5,2— 5,5. A tenyészetet 28 C° tartása mellett steril, 600 l/min. mennyiségű sűrített levegővel leve-60 gőztettük. Hafogátlóként napraforgóolajat alkalmaztunk. A levegőztetés és kevertetés megfelelő hatásfokát 1,2 kW energiát felhasználó keverő segítségével biztosítottuk. Az előfermentáció érettségének megállapítá-65 sara dehidrogenáz enzimaktivitásának mérése 5
