156235. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új ACTH-hatású peptidek előállítására
156235 10 oldatához csepegtetjük, ezután a reakciókeve- 2. példa: réket 15 óra hosszat 0°-on keverésiben tartjuk, végül 500 ml vízzel felhígítjuk. A kivált amorf terméket lenuccsoljuk és 1 :5 arányú dimetilformamid-víz-eleggyel és aoetonitrillel mossuk. A nyers terméket vizes acetonitrilből történő átoldással tisztítjuk. Légnedves állapotra való beállás után 8,62 g (elméleti hozaim 73%) tiszta BOC-dekapaptid-tetrahidrátot kapunk, amelynek olvadáspontja 230—240 C°. [«]20 D = = —15° +2° (c = 0,5; 1:1 piridin-viz^elegyben). A kapott termék a szilikagélen végzett vékonyrétegű kramatografálás során egységesnek bizonyult. 10 R/ (52) =0,3 R/ (101) = 0,6 2. BOC-D-Ser-Tyr-Gly-Met-Glu(OtBu)-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr-Pro-OtBu. 15 20 25 326 mg BOC-D-Ser-Tyr-Gly-Met-Glu(OtBu)-His-Phe^Arg-Try-Gly-OH és 350 mg H-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC)-Lys(BOC)--Lyá(BOC)-Lys(BOiC)-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Try-Pro-OtBu keverékét (v. ö. Cl—672 alapszámú magyar szabadalmi bejelentés) 3,2 ml -piridin, 0,1 ml víz és 0,25 ml In sósav elegyében szuszpendálunk. A szuszpenzióhoz 112 mg diciklohexilkarbodiimidet adunk, részben nem oldódó keveréket még 3,5 óra hosszat 50°-on keverjük, majd mégegyszer előbbivel azonos mennyiségű ditiklohexillkarbodiimidet adunk hozzá és további 4 óra hosszat 50°-on keverjük. A reakciókeveráket végül klb. 2 ml térfogatra bepár dijuk 'ás 40 ml víz hozzáadásával a peptideiket kicsapjuk. A géles-pehelyszerű csapadékot leszűrjük és megszárítjuk. Ezután a dieiklotexilkarbaniid és egyéb lipofilszennyeződések eltávolítása céljából a csapadékot forró metanolban oldjuk, majd benzol-petroléter-eleggyel kicsapjuk. Az így nyert nyersterméket végleges tisztítás céljára metanol^puffer-kloroforim-széntetraklorid 10 : : 3 : 5 : 4 arányú elegyében (a puffer összetétele: 28,5 ml jégecet 19,25 g ammóniumacetát 960 ml vízben) Oraig-^szerint multiplikatív megosztásnak vetjük alá 290 fokozatban mindenkor 10— 10 ml fázistérfogat felhasználásával. A 74—97 megosztási fokozatokból származó anyagot (i"max = 85; K = 0,42) szárazra bepároljuk és az ammóniumacetátot nagyvákuumban 45°-on elszublimáljuk. így kromatográfiás vizsgálattal egységesnek bizonyuló 295 mg védett tetrakozapeptidacetátot nyerünk fehér, amorf por alakjában, amelynek nem éles bomlásp ontja van, kb. 205°-on. A termék szilikagél-vékonyréteg lemezen az alábbi R/ értéket mutatja: R/ (100) =0,61 R/ (75 : 25 arányú kloroform-metanol) = 0,40 65 SO 35 40 45 50 55 60 H-D-Ser-Tyr-Gly-Met-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Lys-Lys•NH2(D-Ser1 -Gly 3 -Lys 17 ' 18 -^ 1 "-18 -kortikatropin-Lys18 -amid) 270 mg BOC-D-Ser-Tyr-Gly-Met-Glu(OtBu)-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys(BOC)-Pro-Val~Gly-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-NH2-ot 13 ml 90%-os trifluorecetsavban feloldunk, 30 percig 22°-on állni hagyunk, majd kb. 2 ml térfogatra bepárolunk. A maradékot 10 ml vízzel felhígítjuk, ismét 3—4 mm térfogatra bepároljuk és liofilizáljuk. A szabad oktadekapeptid fenti módon nyert trifluoracetát származékát acetáttá átalakítás céljára 5 ml vízben feloldjuk és 15 mm átmérőjű, 15 cm hosszúságú, gyengén bázisos acetát formájú ioncserélővel (Merk. No. II) töltött oszlopon az eluátumot néhány ml n^butanollal elegyítjük, kb. 4 ml térfogatra bepároljuk és liofilizáljuk. Így 241 mg kromatográfiás és elaktroforetikus vizsgálattal egységesnek bizonyuló D-Sea^-Gly3--Lysl7 ' 18 -kortikotropin-Lys l8 -amid!aoetátját nyerjük amorf, vízben oldódó por formában. A termék alumíniumoxiddal (DA) és cellulózzal (DC) végzett vékonyrétegű kromatografálása során az alábbi R/^értékek adódnak: DA: R/ (52A) =0,15 R/ (101) =0,35 R/ (104) =0,17 DC: R/ (112A) = 0,26 Papírelektroforetikus vizsgálat során (piridinacetát pufferes közegben, 6,1 pH értéken, 16 Volt(cm) a termék 2 óra leforgása alatt 11,7 cm távolságot migrál a katód felé. A termék a /^"^''-ikortikotropinhoz képest erősen fokozott és nyújtott hatástartalmú kortikotrop hatást mutat. A kiindulóanyagként használt oktadekapeptidszármazékot az alábbi eljárással készíthetjük. BOC-D-Ser-Tyr-Gly-Met-Glu(0.tBu)-His-Phe-Arg-Try-GÍy-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC). _-NH2 2,9 g finoman elporított BOC • D-Ser-Tyr-Gly-Met-Glu(OtBu)-His-Phe-Arg-Try-Gly • OH (1. példa szerinti eljárással előállított termék) és 2,1 g H-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC}-Lys(BOC)-NH2 (vö. Cl— —673. alapszámú magyar szabadalmi bejelentés) keverékét 27 ml piridin, 0,7 ml víz és 2,38 ml 1 n sósav elegyében szuszpendálunk, majd 1,07 g diciklohexilkarbodiimid hozzáadása után 50"on keverésben tartunk. A keverék hamarosan megszilárdul és 3 óra hosszat 50°-on való állás után további 1,07 g diciklohexilfca;rbodiimid 1 ml piridinben képzett oldatával elegyítjük, homogenizáljuk és mégegyszer 4 óra hosszat 50°-on állni hagyjuk. Állás után 300 ml vizet D
