155996. lajstromszámú szabadalom • Eljárás proghrombin visszanyerésére prothrombin-tartalmú adszorbensekről

155996 viszont a nyers prothrombin-oldatok olyan nagymérvű felhígulását okozza, amely közvetlen frakcionálás'ufcát lehetetlenné teszi. Így elvész az adszorpciós módszerek egyik legnagyobb és legfontosabb előnye, az előállítani ki- 5 vánt enzimfehérje betöményítése, és csak kerülő úton valósítható meg. Jóllehet a báriumszulfát-adszorbensről citrát-oldatokkal való leoldás mentes a fenti hátrányoktól, a citrates eluátumok szerves oldószeres frafccionálását 10 már laboratóriumi méretben is megnehezíti, ipari méretben pedig gyakorlatilag kivihetetlenné teszi a nagymennyiségű citrát-ion jelenléte. A prothrombin és a citrát-^ionok affinitásán és a tömeghatás-törvényen alapuló eme 15 visszanyerési mód ezenkívül korántsem kvantitatív, így kedvezőtlenül befolyásolja a hozamokat. A találmány célja olyan eljárás biztosítása, amely kiküszöböli az ismert megoldások hátra- 20 nyait és a prothrombin visszanyerését egyszerű és könnyen kivitelezhető technológiával gazdaságosan teszi lehetővé. Találmányunk alapj felismerés, hogy prothrombin-tartalmú adszorbensekről a pro- 25 thrombin bizonyos szulfát-sók vizes oldatával közvetlenül és kvantitatíve visszanyerhető, a vizes oldatból a sókoneentráció növelésével kicsapható és izolálás után gyógyászati célra is alkalmas tisztaságú thrombin-készítménnyé ala- so kítliató. Ez a felismerésünk azért meglepő, mert ismeretes, hogy a sósav alkáli-, ammónium- vagy magnéziumsója teljesen hatástalan a prothrombin adszorbensekről való visszanyerése terén, jóllehet a prothrombin oldékony- £5 sága kitűnő ezekben a sóoldatokban. Nem volt tehát 'előre várható, hogy a prothrombin viszszanyerése szulfátsók vizes oldatával az eddig ismert eljárásoknál lényegesen hatékonyabban és technológiailag könnyen kivitelezhetően va- 40 lósítható meg. A találmány javított eljárás prothrombin visszanyerésére prothrombin- tartalmú adszorbensekről, amely abban áll, hogy a kísérő fehérje-szennyezésektől mentesített adszorbenst 45 kénsav alkáli-, ammónium- és/vagy magnéziumsójának vizes oldatával eluáljuk 0—0,105 mól/ /liter citrát-ion jelenlétében, majd az adszorbensről így leoldott protihrombint a vizes oldatból a sókoneentráció növelésével kicsapjuk so és izoláljuk. A találmány szerinti eljárás egyik előnyös foganatosítási módja szerint a prothrombin visszanyerésére a kénsav alkáli-, ammőniumés/vagy magnézium-sóját 0,2!—12,5 mól/liter kon- 55 centrációbain használjuk, és a leoldást 0—40 C° közötti hőmérsékleten, előnyösen szobahőmérsékleten végezzük. Az adszorbensről leoldott, majd attól elkülönített nyers prothrombinit vizes oldatából a szulfát-ionok konoent- 60 rációjának növelésével célszerű kicsapni és izolálni. A találmány szerinti eljárás értelmében célszerűen úgy járunk el, hogy a kísérő fehérjeszennyezésektől előzetesen élettani konyhasó- 65 val és desztillált vízzel kimosott és elkülönített adszorbenshez szobahőmérsékleten kb. 2,0 mólos ammóniumszulfát oldatot adunk 0,01— 0,05 mól/liter citrát-ion. jelenlétébem, az adszorbenst az oldószerrel szétdörzsöljük, majd 2 órán át fcevertetjük, [Ezután a prothrombin-tartalmú eluátumot az adszorbenstől elkülönítjük, majd a leoldást újabb oldószer-mennyiséggel megismételjük; az adszorbens elkülönítése után a két eluátumot egyesítjük és a prothromhint azonos térfogatú telített ammóniumszulfát-oldat hozzáadásával kicsapjuk, majd elkülönítjük és a sók eltávolítása után izoláljuk, A találmány szerinti eljárásnak az ismert prothrombin-visszanyerési módszerekkel szemben fő előnye az, hogy hatékonyabb azoknál, és lényegesen egyszerűbb, technikailag könnyen kivitelezhető és gazdaságos módon teszi lehetővé a prothrombin leoldását. A találmány szerinti eljárás foganatosításiára az alábbi kiviteli példákat adjuk meg,. 1. példa: 2 liter oxalátos marhaplazmából a prothrombint Belitser és mtsa módszerével báriumHszulfátra adsziorbeáltlatjuk, majd az adszorbenst centrifugálással elkülönítjük, és előbb élettani konyhasóval, majd desztillált vízzel kimossuk. Ezután 60 ml 2, mólos ammómiumszulfát-oldatot adunk hozzá és szobahőmérsékleten 1 órán át kevertetünk. Az eluátumot centrifugálással elkülönítjük, majd a leoldást 40 ml oldószerrel megismételjük. A két eluátumot egyesítjük 'és szobahőmérsékleten 0,02 mól/liter citrát-iont tartalmazó, azonos térfogatú telített ammóniumszulfát-oMatot adunk hozzá. Az így kicsapott prothrombint azonnal centrifugáljuk, desztillált vízben oldjuk és váltott desztillált vízzel szemben szulfát-ionmentesre dializáljuk. A dializátumból 2—4 C°-ra való lehűtés után a prothrombint másfélszeres térfogatú, —20 C° hőmérsékletű acetonnal kicsapjuk és megszárítjuk. A végtermék súlya — a kiindulási plazma minőségétől függően — 60—1120 mg/liter plazma, aktivitása a nemzetközileg legáltalánosabban használt N. I. ;H. (National Institute of Health) egységekben 120—60 E/mg. A hozam: 6C0O—12'OiQO E/liter plazma. 2. példa: 2 liter 10 C° hőmérsékletre hűtött oxalátos .marhaplazmához ugyanilyen hőmérsékletű, 800 ml 2;%-os nátrium-oxalát-oldiatot, majd 200 ml 10%-os báriumklorid-oldatot adunk és 30 percig kevertetünk. Ezután hűtőszobában ülepedni hagyjuk az adszorbenst, majd a levet leszívatjuk és további felhasználásra félíeteszszük, A báriumoxalát-prothrombin csapadékot centrifugáljuk és sorrendben a következő mosásoknak vetjük alá: a) 3 x 100 ml élettani konyhaséoldattal; b) 1 x 100 ml 9%-os konyhasóoldattal; c) 2'X'IOO ml desztillált vízzel. Az egyes mosások után a mosólevet centrifugálás-2