155987. lajstromszámú szabadalom • Eljárás tumorsztatikus hatású szer előállítására
3 155987 4 kozó kezelési műveleteknek (penicillintartalmú közegben való szuszpendálás és 37 C° hőmérsékleten való infcubáltatás) alávetett sejt-szuszpenziót még egy további, magasabb, 38—50 C° on, előnyösen 45 C° körüli hőmérsékleten történő kfo. félórai hőkezelésnek vetjük alá. A találmány tehát oly eljárás tumorsztatikus hatású szer előállítására, amelyet az jellemez, hogy a Streptococcus haemolyticus sejtjeit egy glükóz-adalék nélküli tápközegben tenyésztjük, a sejteket elkülönítjük és egy penicillint legalább 25 00O egység/ml koncentrációban tartalmazó közegben szuszpendáljük, majd előbb 30—• 38 C° hőmérsékleten inkubáltatjuk, ezt követően pedig 38—50 C° hőmérsékletre hevítjük őket. Az inkubáltatást előnyösen 10—30 percig, a hevítést pedig 20—60 percig folytatjuk. A találmány szerinti eljárásban előnyösen oly Streptococcus haemolyticus sejteket alkalmazunk, amelyeket glukóz-adalék nélküli tápközegben tenyésztettünk. Tápközegként például húsfőzet, előnyösen kb. 0,5—1 súly/tf% RNA és/vagy RNC tartalmú tápfőzet alkalmazható. A húsfőzet helyett jó eredménnyel alkalmazhatunk a tenyésztéshez más természetes vagy félszintétikus tápközegeket is, glukózt azonban ezekhez se adjunk, mert glukóz jelenléte esetén a kapott szer tumorsztatikus hatása erősen csökken. A mikroorganizmus tenyésztési időtartaima előnyösen kb.13—20 óra lehet; ettől az időtartamtól azonban kisebb eltérések is lehetségesek. Az adott esetben legcélszerűbb tenyésztési időtartam a tápközeg összetételétől és az inkubált ími'kroorganizmusolk (mennyiségétől is függ. A mikroorganizmus tenyésztését nyugvó kultúrában, kb. 30—39 C° hőmérsékleten végezhetjük. Az így lefolytatott tenyésztés után a kapott mikroorganizmus-sejteket, amelyeket az alábbiakban röviden kokkuszoknak nevezünk, a tenyész-közegtől elválasztjuk, pl. lecentrifugáljuk és az üledékként kapott kokkuszokat valamely erre alkalmas szuszpendáló-közegben szuszpendáljük; ilyen szuszpendáló közegként pl. valamely sóoldat, előnyösen a Bernhelmer-féle bazáüs közeg (az alábbiakban: BBM) alkalmazható, amely maltózt, káliumhidrogénfoszfátot és magnéziumszulfát-heptahidrátot desztillált vízben tartalmazó, 6,8—7,0 pH-értékű vizes oldat. Alkalmazható azonban szuszpendáló közegként foszfáttal pufferolt nátriumkloridolriat is. A penicillint előzetesen adhatjuk a szuszpendáló közeghez, de hozzáadihatjiuk »már a kokkuszok szuszpenziójához is. A penicillin mennyisége a hatásosság szempontjából előnyösen 25 000 egység/ml felett, különösen 27 000 egység/ml és 60 000 egység/ml között lelhet, Az így kapott penicillin-tartalmú kokkuszszuszpenziót először legalább 10 percig, előnyösen 10—30 percig 30—38 C° hőmérsékleten inkubáltatjuk, majd ,20—'60 percig 38—>50 C° hőmérsékletre hevítjük, A legjobb eredményeket akkor kapjuk, ha az inkubáltatást 37 C° hőmérsékleten 20 percig, majd az ezt követő hevítést 45 C° hőmérsékleten 30 percig folytatjuk. A találmány szerinti eljárással a Streptococcus haemolyticus sejtjeinek tumorsztatikus hatása attól függetlenül növelhető, hogy a kokkuszok virulens vagy avirulens állapotúak-e. A kokkuszok virulenciája azonban a kezeléssel egyidejűleg jelentősen csökken, S-sztreptolizin képzésére való képességük pedig teljesen elvész. Gyógyszerkészítmény előállítása céljából a kokikusz-szuszpenziót a tenyésztés után aszeptikussá tesszük és az aszeptikus szuszpenziót a kívánt koncentrációra hígítjuk. A találmány szerinti eljárás gyakorlati kiviteli módjait közelebbről az alábbi példák szemléltetik. A példákban szereplő két Streptococcus haemolyticus törzset, a csaknem avirulens „Su" és a virulens „Sv" törzset ATCC 21060 ill. ATCC 21059 sz, alatt letétbe helyeztük, Benyújtottuk a törzseket az Orsz. Közegészségügyi Intézethez is. 1. példa: A Strept'Oicoccus-szuszpenziók előnyös penicillin-koncentrációját az alábbi módon határoztuk meg: A Streptococcus haemolitious ATCC 2,10'60 20 órás kultúrájának 100 ml-jéből kapott élő sejteket fiziológiás nátriumkioridoldíattal kétszer mossuk, majd 6 ml Bernheimer-féle BBM közegben szuszpendáltuk őket. Az így kapott kokkusz-szuszpenziót az alábbi példákban ugyancsak BBM közeggel hígítottuk tovább 1:5 és 1:10 hígítású szuszpenziókká. Benzilpenicillin (G-penicillin) fiziológiás nátriumkloridoldattal készített, ,2—32;x,104 E/ml koncentrációjú oldatának 0,5 ml-jéhez 2,5 ml fenti módon készített, 1:10 hígítású kokkuszszuszpenziót adtunk. Az így készített elegyet tartalmazó kémcsövet azután 20 perc időtartamra egy 32 C° hőmérsékletű fürdőbe állítottuk. 30 ml tejszerűen zavaros ascites-folyadékot, amelyet 8 nappal ezelőtt Erlich-fféle ascites-tumoirral fertőzött egerek hasüregéből vettünk, 5 percig centrifugáltunk, percenként 1500 fordulattal. A leülepedett ráksejteket jéggel hűtött nátriuimkloriddal egyszer, majd jéggel hűtött BBM közeggel ugyancsak egyszer mostuk, azután BBM közegben szuszpendáltuk ezeket oly módon, hogy a szuszpenzió imilliliterenkint 6O>x;l ,ll0 6 sejtet tartalmazzon. Az így kapott ráksejt-szuszpenzió 1 ml-jét adtuk mindenkor 3 ml penicillines kokkuszszuszpenzióhoz és az elegyet 90 percig inkubáltuk 37 C° hőmérsékletein. Az inkubált penicillin tartalmú elegyet 0,5 iml mennyiségben adtuk be egereknek intriaperitoneális úton. Az egyes kísérleti csoportok 6—6 egérből álltak. A kísérlet folyamán elhullott egereket megvizsgáltuk a halál okának megállapítása céljából. 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2
