155873. lajstromszámú szabadalom • Eljárás tisztított amiloglukozidáz-készítmények előállítására

155873 8 keményítőoldatot 50-^65 óra hosszat hidrolizáljuk tovább 60 C° hőmérsékleten. A hidrolízis befejeztével a glukóztartalmat oly módon határozzuk meg, hogy a jelenlevő redukáló cukor-mennyiséget Somogyi és Nelson módsze- 5 révei (ismerteti: J. Biol. Chem. 195, 19, 1952) mérjük és az eredményből a D. U.-értéket a fent megadott módon kiszámítjuk. A találmány szerinti eljárás előnyös kiviteli alakjainak szemléltetésére az alábbi példák 10 szolgálnak; meg kell azonban jegyezni, hogy a találmány köre egyáltalán nincsen ezekre a példákra korlátozva. 1. példa: 15 a) Egy Aspergillus niger kultúra szűredékének 400 ml-jéhez, amely 46,5 E/ml aktivitást tartalmaz, szobáhőfokon, keverés közben 18 ml 1,5 N sósavoldatot adunk, 1,88 pH-érték elére- 20 séig. 24 óra alatt azután megfelelő számú mintát veszünk és meghatározzuk e minták amiloglukozidáz- és transzglukozidáz-aktivitását. Az alábbi táblázat adatai mutatják, hogy 24 óra elteltével az eredetileg jelen volt transzgluko- 25 zidáz-aktivitás 90%-a elbomlott. Az eredeti enzimkészítmény magas aktivitását tehát a kezelés kb. 3%-kal növelte. 2. példa: a) 1650 liter teljesen kifejlődött Aspergillus niger kultúrához, amelyben a micélium még jelen volt és amely 60,4 E/ml aktivitást tartalmazott, keverés közben, 21 C° hőmérsékleten 65 liter 1,5 N sósav oldatot adtunk, 1,91 pH-érték eléréséig. A pH-értéket 24 óra hosszat állandó szinten tartottuk, 21 C° hőmérsékleten tartva az elegyet. 24 óra elteltével a folyadék pÍH-értékét 20 liter 6 N ammóniumhidroxid-oldat hozzáadásával 4,2-re állítottuk. Az amiloglukozidáz-aktivitásnak az e kezelés során bekövetkezett csökkenése 4% volt, míg a transzglukozidáz-aktivitás 92%-ban elpusztult. b) Az enzim-készítménnyel a savas kezelés előtt ill. a savas kezelés után elérhető D. U.-értéket az 1. példa b) pontjában leírt módon határoztuk meg. Ebben az esetben 9,5 ml savval kezelt enzimkészítményt ill. 8,8 ml nem kezelt készítményt adtunk 150 g előhidrolizált keményítőhöz; a hozzáadott enzimkészítmény összes aktivitása mindkét esetben kb.' 525 E volt. 64 óra elteltével meghatároztuk a D. U.-értéket és Eltelt idő órákban Amiloglukozidázaktivitás %-ban Transzglukozidázaktivitás %-ban az . alábbi eredményeket kaptuk:' su : "--— •— Savas kezelés Savas kezelés 0 100 100 100 98 előtt után 1,50 100 100 100 98 3 4,50 98 96 78 57 D. U.-érték 94,9% 35 98,5% 6 95 41 Ebben az esetben tehát a kezeléssel elérhető 16 24 95 95 20 10 javulás mértéke meghaladta a 3,5%-ot. b) A fentihez hasonló módon kapott 1,88 40 pH-értékű kultúra-szűredéket 2 n ammóniumhidroxidoldattal 4,5 pH-értékre állítjuk be. 150 g .burgonyafceményítőt 250 ml vízben alfa-amilázzal 80 C° hőmérsékleten elő-hidrolizálunk, kb. 10 D. U.-értékre. Az oldatot azután autó- 45 klávban 135 C° hőmérsékleten kezeljük az alfaamiláz inaktiválása céljából, majd 50 ml 4,0 pH-értékű nátriumacetát-pufferoldatot adunk hozzá. Ezután 12 ml kezeletlen enzim-készítményt adunk az elegyhez, amelyet előzőleg 4,5 50 pH-értékre állítottunk be a 2 N ammóniumhiidroxiddal. Az előhidrolizált keményítő ugyanilyen mennyiségéhez 1*3,6 ml oly enzimkészítményt adunk, amelyet az a) alatt leírt módon kezeltünk. Az így kapott két elegy egyenként kb. 55 525 E aktivitást tartalmaz. Az elegyeket 64 óra hosszat 60 C° hőmrésékleten tartjuk, majd meghatározzuk azok D. U.-értékét. Az alábbi eredményeket kapjuk: 60 Savas kezelés előtt Savas kezelés után D. U.-érték 95,2% 98,1% 65 3. példa: a) 200 ml amiloglukozidáz-koncentrátumhoz, amelynek aktivitása 528 E/ml volt, 23 C° hőmérsékleten, keverés közben 44 ml 1,5 N sósavoldatot adtunk. A hozzáadás után az elegy pH-értéke 2,40 volt. A megsavanyított koncentrátumot 6 óra hosszat tartottuk 23 C° hőmérsékleten, a pH-értéket állandóan 2,40-nél tartva. Ezután 33 ml 2 N ammóniumhidroxidoldatot adtunk hozzá és így a pH-érték 4,2-re emelkedett. A savas kezelés után az amiloglukozidáz-aktivitás 365 E/ml volt. Az aktivitásveszteség tehát, a térfogatváltozásnak megfelelő korrekcióval 4%. A transzglukozidáz-aktivitás csökkenését denzitometriás módszerrel határoztuk meg és azt 89%-nak találtuk. b) Az elérhető maximális D. U.-értéket az 1. példa b) pontjában leírthoz hasonló módon határoztuk meg, olyképpen, hogy 1,0 ml nem kezelt enzimkészítményt ill. 1,4 ml savval kezelt enzimkészítményt adtunk az előhidrolizált keményítőoldathoz, amely mindkét esetben 150 g keményítőt, 250 g vizet és 50 ml 4,0 pH-értékű nátriumacetát-pufferoldatot tartalmazott. A találmány szerinti kezelés előnyös eredménye az alábbi táblázatból tűnik ki: 4