155872. lajstromszámú szabadalom • Eljárás immunokémiai meghatározások céljaira alkalmas eritrocita-készítmény előállítására

3 szonylag hosszú ideig stabilak. Szükség van azonban olyan készítmény-alakokra, amelyekben az eritrociták jól kezelhetők, ugyanakkor kellő mértékben stabilak és megtartják valamennyi oly tulajdonságukat, amely lényeges az immunokémiai meghatározási módszerek lefolytatására. Meglepő módon sikerült egy e követelményeket kielégítő módszert találnunk az antigének immunokémiai meghatározására alkalmas eritrocita-készítimény előállítására, amelynek során az eritrocitákat egy- vagy többféle cserzőanyaggal kezeljük, majd antigénnel érzékenyítjük; ezt az eljárást az jellemzi, hogy az érzékenyítés utolsó lépését formaldehid 2 súly/tf% alatti koncentrációban való jelenlétében, 5,5 és 8 közötti pH-értéken végezzük. Az így kezelt eritrociták mechanikai tulajdonságai oly mértékben javulnak, hogy ezeket az eritrocitákat tablettákká sajtolhatjuk és azok ilyen állapotban is megtartják inimunokéimiai reakciókhoz való felhasználhatóságukat a tablets táknak a megfelelő közegben való szuszpendálása után. Ismeretes volt már a 3 096 250 sz. amerikai szabadalmi leírásból a formaiinnal előkezelt eritrociták formaliinoldat jelenlétében való érzékenyítése; ezt az alkalmazott antigén izoelektromos pontjától számított 2 egységen belüli pH-értéken végezték. Ez azt jelenti, hogy ha az antigén HCG volt, amelynek izoelektromos pontja 2,98, akkor az érzékenyítést 5 alatti pH-értéken kellett végezni; ez eltér a találmány szerinti eljárástól, amelyben csupán 5,5 feletti pHnértéken érünk el jó eredményeket. További különbség az, hogy az ismert eljárás esetében magasabb, 2% és 10% közötti formalinkoncentrációkat alkalmaztak, míg a találmány szerinti új eljárás esetében ez a koncentráció 2% alatt, sőt előnyösen 0,25 súly/ /tf% alatt van. Végül, az említett szabadalom szerint a formaldehid jelenléte az egész érzékenyítési eljárás során szükséges, ami szintén eltér a jelen találmány szerinti eljárástól. összehasonlító kísérleteket végeztünk a találmány szerinti kezelési móddal, HCG antigénként való alkalmazásával, különböző pH-értékeken, egyébként a fentidézett szabadalmi leírás 1. példájában megadottakkal egyező körülmények iközött. Ezekből a kísérletekből világosan kitűnt, hogy 4,4 és 5,0 közötti pH-értéken a kezelés nem ad immuno-kéimiai meghatározások céljaira alkalmas eritrocitákat. Azt találtuk továbbá, hogy kitűnő eredményeket kapunk oly eritrocitákkal, amelyek előkezelése előbb formaiinnal, majd tanninnal történik. Ez a módszer különösen jól alkalmazható o-yan esetekben, amikor emberi korion gonadotropint (HCG) alkalmazunk antigénként. A HCG koncentrációja előnyösen 10—50 NE/ /ml lehet. Ha igen tiszta HCG kerül felhasználásra, a koncentrációt kb. 200 NE/ml-re kell emelni. Äz érzékenyítés folyamán, amely HCG alkalmazása esetén rendszerint egy vagy több napot vesz igénybe, a formaldehidet csupán az utolsó 12—24 óra folyamán hagyjuk hatni az eritrocitákra, előnyösen az utolsó 15 óra folyamán. A legelőnyösebb hatást 30—40 C hőmérsékleten, különösen előnyösen 37 C°-on 5 érjük el. Azt találtuk továbbá, hogy ha HCG kerül antigénként alkalmazásra, a találmány szerinti kezelés különösen 6,4 körüli pH-értéken ad igen jó eredményeket. 10 A találmány keretében kidolgoztunk továbbá egy eljárást az immunokémiai meghatározások céljaira alkalmas eritrociták tablettákká vagy más szilárd adagolási egységekké való alakítására; ezt az eljárást az jellemzi, hogy a 15 találmány szerinti módon kezelt eritrocitákat a tablettázáshoz szükséges segédanyagokkal, valamint az immunokémiai meghatározáshoz szükséges anyagokkal keverjük, majd megfelelő adagolási egységekké sajtoljuk a keveré-20 keit. Számos kísérletet végeztünk az érzékenyített eritrocitákból előállított szuszpenziókkal, legnagyobbrészt egy vagy két heti tárolás után, továbbá az e szuszpenzió fíagyasztva-szá-25 rítása útján kapott porokkal, ugyancsak egy vagy két heti tárolás után, végül az ilyen porokból előállított kb. 15 mg súlyú tablettákkal, hogy megállapítsuk a találmány szerinti kezelési mód legelőnyösebb kiviteli körülmé-30 nyeiit. Ezeket a kísérleteket az alábbi módon folytattuk le: Valamely megfelelő antiszérumból hígítási sorozatot készítettünk és az így kapott adagokhoz meghatározott mennyiségű vizeletet ad-35 tunk HCG nélkül. A vizsgálandó eritrocitakészítményt az így kapott eleggyel kevertük, majd megvizsgáltuk, hogy az eritrociták teljesen agglutinálódnak-e az antiszéruim nagy hígítású oldatával. Ugyanezt az eritrocitaké-40 szátményt hozzáadtuk ugyanilyen antiszérum-hígítás és vizelet HCG hozzáadásával készült keverékéhez is. Az eredményt csak akkor tekintettük elfogadhatónak, ha rövid időn, pl. 2 órán belül 1 NE/ml HCG jelenlétében lépett 45 fel a hatás, vagyis ha a HCG-tartaimú eritrocita-készítmény megfelelő hígítású antiszérummal való agglutinálódása 1 NE/ml HCG-tartalmú vizelettel teljesen gátolható volt; 50 A találmány szerinti eljárással kezelt eritrociták eléggé szilárdakká válnak ahhoz, hogy pl. tablettákká sajtolhatok legyenek. E célra oly szokásos segédanyagokat alkalmazunk, amelyek nem támadják meg az eritrocitákat és a 55 hozzájuk kapcsolódó antigént. Természetesen az antigén és az eritrociták között fennálló kötést sem szabad a segédanyagnak hátrányosan befolyásolnia és amellett nem szabad számottevő hatást gyakorolnia az eritrociták felhasz-60 nálásával végzendő meghatározásra sem, tehát oly segédanyagok alkalmazandók, amelyek sem a meghatározás érzékenységét és pontosságát* sem a meghatározás alapját képező reakció sebességét nem változtatják meg észrevehető 35 módon. 2