155679. lajstromszámú szabadalom • Eljárás mitramicin előállítására mikrobiológiai úton

5 kum és az autentikus mitramicin teljesen azonos R, értékeket (0,38) adott aceton-benzol-víz (10 : 3 : 2) és benzol-metanol (2 :1) rendszerben (0,30). A találmány szerinti eljárást az alábbi kiviteli 5 példákkal szemléltetjük: 1. példa Az Actinomyces iverim (1-515) spóraszuszpenziójával (a spóra termelése burgonyakivonat- 10 glukóz agáron történt a szokásos módon) beoltottunk 2 db 500 ml-es Erlenmeyer-lombikban levő alábbi összetételű táptalajt (100 ml): 4% glicerin (térf.%) , 2% amerikai mogyoró liszt 15 0,3% NaCl 0,2% kazein-hirolizátum (kazeinre számítva) 0,5% CaC03 pH 6,8—7,0 sterilezés előtt. Az inokulum-tenyés^etet 48 órán át rázattuk 20 28 C°-on síkrázógépen, majd 100 1 hasznos térfogatú üzemi fermentort oltottunk vele, amelynek táptalaj-összetétele a következő volt: 4% glicerin (térf.%). 2% amerikai mogyoró liszt 25 0,2% kazein-hidrolizátum (kazeinre számítva) 0,3% NaCl 0,3% NaCl 0,5% CaC03 belefőzve 0,3% pálmaolaj habgátló, adagolás- 30 ra a szokásos módon előkészítve ugyanennyi. pH 6,8—7,0 sterilezés előtt. A táptalaj sterilezése 30 percen át 121 C°-on történt. A fenti inokulummal való oltás után a tenyésztést 28 C°-on végeztük a szokásos módon, kever- 35 tetés közben. A fermentort 100 liter/perc sebességgel levegőztettük. A 48., 72., 96. és 120. órában 1% glukózt adagoltunk a tenyészethez 50%-os oldatban. A fermentlé a tenyésztés 140. órájában 1400 [ig/ml antibiotikumot tartalmazott. 40 A meghatározás biológiai értékméréssel Bac. subtilis-szel történt a szokásos módon. 2. példa Az Actinomyces vyerini (1-515) spóraszuszpen- 45 ziójávai beoltottunk egy 100 liter hasznos térfogatú üzemi fermentort, és az 1. példában megadott módon 48 órán át tenyésztettük, majd továbboltottuk egy 100 liter hasznos térfogatú fermentorba, amelynek táptalaj-összetétele a követ- 50 kező volt: 4% glicerin (térf.%) 2% amerikai mogyoró liszt 0,2% kazein-hidrolizátum (kazeinre számítva) 0,3% NaCl 55 0,5% CaCOs belefőzve 0,3% pálmaolaj habgátló, adagolásra a szokásos módon előkészítve ugyanennyi, pH 6,8—7,0 sterilezés előtt. A 48., 72., 96. és 120. órában 1—1% glukózt 60 adagoltunk. A szokásos módon végzett fermentáció 140. órájában 1800 |ig/ml antibiotikum termelési szintet értünk el. 100 liter fenti módon készült erjesztéses oldatot — melynek mitramicin-tartalma 0,98 g/liter 65 6 és pH-ját telített oxálsav-oldattal %•—3-ra állítottuk — szűrtünk, majd 15 kg nátriumklorid hozzáadása után 25 1 és 15 1 etilacetáttal extraháltunk. Az etilacetátos kivonatokat egyesítettük és 3X10 liter 0,05 n nátriumhidroxid-oldattal kivontuk belőle az aktív anyagot. Az egyesített nátriumhidroxidos kivonat pH-ját 4-re állítottuk telített oxálsav-oldattal, majd 6 kg nátriumklorid hozzáadása után 2X6 1 etilacetáttal extraháltuk azt. Az egyesített etilacetátos kivonatot nátriumszulfáton szárítottuk, majd szűrés után 350 ml-re pároltuk be vákuumban. A bepárlási maradékhoz szobahőmérsékletre történő lehűtés után 1 liter étert adtunk. A kivált terméket szűrtük, majd 300 ml éterrel mostuk; szűrés után szárítottuk. A termék súlya: 67,60 g, aktivitása a standard 80%-a. Kitermelés 55%. 3. példa Mindenben a 2. példa szerinti módon jártunk el, azzal a különbséggel, hogy a második etilacetátos kivonás helyett 2 X 10 1 kloroformot használtunk, majd a kivonatot 200 ml-re pároltuk be. A továbbiakban ismét a 2. példa szerint jártunk el. Kitermelés 53%. 4. példa 17 g 80% aktivitású nyers terméket 200 ml 4 pH-jú oxálsav-oldatban oldottunk, majd 3X400 ml etilacetáttal kivontuk az antibiotikumot. Az egyesített kivonatot bepároltuk 50 ml-re, majd 200 ml éter hozzáadásával kicsaptuk az aktív anyagot, szűrtük, és 100 ml éterrel mostuk, vákuumban szárítottuk. 9,9 g terméket kaptunk, mely 88,5% tisztaságú. Kitermelés 64,5%. Az anyalúgban és a vizes fázisban maradt szennyezett terméket bepárlás, illetve kisózás és extrakció után visszanyertük és újabb tisztításnak vetettük alá. Az előbbiekben ismertetett előtisztítás során nyert anyag 6 g-ját 200 ml etilacetátban feloldottuk. Az oldhatatlan maradékot szűréssel eltávolítottuk. A szűrletet 40 cm magas és 2 cm belső átmérőjű, oxálsavval és etilacetáttal előkezelt, semlegesre mosott alumíniumoxid-oszlopra vittük. A kromatogramot 50 ml etilacetáttal fejlesztettük ki. Az eluálás fokozatosan, 1—10% metanolt tartalmazó etilacetáttal történt. Az aktív frakciókat 1/10 térfogatra pároltuk be. A bepárlási maradékhoz 5-szörös térfogatú étert adtunk; a kivált antibiotikumot szűrtük és 30 ml éterrel mostuk. A főfrakciókból kinyert antibiotikum 3,80 g, 100% aktivitású. Kitermelés: 72%. A mellékfrakciókból kipreparálható még az összes bevitt aktív anyag 18%-a. Ezt az anyagot a következő kromatográfiához vittük be. Szabadalmi igénypontok 1. Eljárás mitramicin előállítására mikrobiológiai úton, azzal jellemezve, hogy az előállítást rázott tenyészet és előfermentáció közbeiktatása után komplex fehérjét, szénhidrátot és szervetlen sókat tartalmazó táptalajon Actinomyces iverini (1-515 jelű) törzzsel (az Országos Közegészségügyi Intézetnél letétbe helyezve 43. szám 3