155617. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rubidomicin előállítására

Í55617 metilénkloridot vagy kloroformot, vagy ezeknek az oldószereknek az elegyét. Az ásványi savak (sósav, foszforsav, kénsav) vagy a szerves savak (ecetsav, oxálsav stb.) különféle koncentrációkban alkalmasak, de legelőnyösebb a sósav és az oxálsav 0,01 és 1 n között. Az átalakítani kívánt termék koncentrációja a reakciókeverékben 0,01 és 5% között változhat. A hidrolitikus reakciót 10 és 75 C° között hajtjuk végre; a reakcióidő a hőmérséklet függvénye, és 48 óra és 30 perc között változhat. Előnyösen a hidrolízist 20 C°-on 15 óra és 50 C°-on 1 óra között hajtjuk végre. A reakció befejeztével a rubidomicint az antibiotikumok elkülönítésének és tisztításának hagyományos módszerei szerint nyerjük ki a reakciókeverékből. A rubidomicint, a 13 213 R. P. és 13 567 R. P. antibiotikumokat meg kell tudni határozni vizes, szerves vagy vizes-szerves oldataikban, a nyers termékekben, a féltiszta termékekben és a tiszta termékekben, hogy megállapíthassuk a hidrolízis optimális körülményeit és a végtermék összetételét. Az elemzési eljárások a különféle összetevők fizikai-kémiai és biológiai tulajdonságainak különbségén alapulnak. Cellulózon való megosztásos vgay kovasavgélen való abszorpciós kromatografálás többféle oldószer-rendszerben, mint például kevés szénatomos alkohol-víz, kevés szénatomos alkohol-alifás savészter-víz, használható fel, minthogy a két fő alkotórésznek és az aglikonnak eltérő az Rf-je. Minthogy az anyagok természetüknél fogva színesek, elválaszthatók vékonyréteg- vagy oszlopkromatográfiával, és meghatározhatók spektográfiásan egy etalonnal összehasonlítva, vagy egyszerűbben: az elválasztott termékek átalakíthatók erőteljes hidrolízissel a 13 657 R. P. aglikonná, kiértékelhető a kromofor-csoport százalékos aránya, és ebből kiszámítható az összetevők százalékos mennyisége. Másrészt a két alkotórész biológiai hatékonysága in vitro különböző, az ágiikon pedig nem hatékony. Ha feltesszük, hogy a tiszta rubidomicin bázis alakjában megfelel 1000 /íg/mg-nek, a 13 213 R. T. tiszta alakban jßO 000 ,ag/mg-nek felel meg turbidimetriás meghatározásai, Klebsiella pneumoniae-t alkalmazva érzékeny törzsként. Ez a különbség lehetővé teszi nemcsak a nyerstermékek és az oldatok elemzését, de igen kis 13 213 R. P.-tartalom kimutatását is a tisztított rubidomicinben. Ennek végrehajtására elégséges a termékeknek a fentebb leírt módon való kromatografálása, és a kromatogramoknak Bacillus subtilis-szel vagy Klebsiella pneumoniae-val beoltott agar-agaros táptalajon való bioautográfiás kiértékelése. Az alábbi példákon szemléltetjük a találmány gyakorlati végrehajtását anélkül, hogy azt ezekre a példákra kívánnánk korlátozni. A példákban megadott hozamok a következőképpen vannak definiálva: Hozam = a kapott termék rubidomicintartalma a kezelt termék rubidomicintartalma X100 5 1. példa 5 mg/ml koncentrációjú oldatot készítünk rubidomicinből és 13 213 R. P.-ből 1 :1 arányú etilacetát-metanol elegyben. Mindegyik oldathoz annyi 1 n sósavat adunk, amennyi megfelel 10 4 ml-nek 1 g kiindulási anyagra számítva. Az oldatokat 25 C°-ra melegítjük, és kevertetjük. Meghatározott időközökben (1. óra, 4. óra, 9. óra, 20. óra) kiveszünk mindkét oldatból 0,5 ml-t, és 10 ml éterrel kicsapjuk. Szűrjük, mossuk 15 és megszárítjuk a kapott csapadékot. Ezután körkromatografáljuk. 4,8 pH-s foszfátpufferral itatott Arches n° 302 papíron, futtatóként vízzel telített n-butanolt használva. Kivágjuk a rubidomicinnek, 13 213 R. P.-nek és 13 567 R. P.-20 nek megfelelő látható zónákat, és eluáljuk azokat 5 ml 9:1 térfogatarányú metanol-sósav eleggyel. Az eluátumokat másfél órára 50 C°-ra melegítjük a rubidomicinnek és a 13 213 R. P.nek 13 567 R. P.-vé való hidrolizálására. Meg-25 mérjük az oldatok abszorpcióját 480 nm-nél, és ebből következtetünk a rubidomicin-, 13 213 R. P.- és 13 567 R. P.-tartalomra. Az 1. táblázatban összefoglaltuk a kapott eredményeket: 30 *, 35 40 45 50 55 60 CO CO r-l in o OS o 03 co o OS © CO CD CO o © OS 05 l-l © o © Irt in 2. példa 3,25 mg/ml koncentrációjú oldatot készítünk rubidomicinből és tiszta 13 213 R. P.-ből 1 :1 arányú etilacetát-metanol elegyben. Hozzáadunk annyi 1 n sósavat, amennyi megfelel 4 ml-nek 65 1 g kiindulási anyagra számítva. Felmelegítjük 2 Meghatározott összetevők rubidomicin 13 567 K. P. 13 213 R.P. rubidomicin 13 567 R. P. Termék rubidomicin 13 213 R. P. 1. táblázat %-os tartalom, az idő függvényében Ö~h Th 4~h 9li 2Ö"h