155527. lajstromszámú szabadalom • Eljárás Streptomyees és Penicillium-fajok mutagén kezelésére és fermentálására
155527 6 Az így összemért anyagot 45 percig 25 C°-os thermosztátba helyeztük, és gondoskodtunk állandó kevertetéséről. 45 perc eltelte után az MBA biológiai hatását urotropin adagolásával állítottuk le olymódon, hogy az MBA : urotropin mól arány 1 :3 volt. Az így nyert elegyből 2—2 ml-t 5X210 cm2 felületű, Blék üvegben elkészített szilárd táptalajra szélesztettünk. A szélesztményekből táptalajonként kifejlődött telepek száma átlagából kiszámítottuk, hogy a letalitás 91,4%-os volt. Az elegy további részletéhez táptalaj sűrítményt kevertünk olyan mennyiségben, hogy a végtérfogatban 5000 db/ml spóra 0,0035 mól MBA 0,015 mól NaHC03 1% szorbit 0,25% corn steep liquor 0,1% szójaliszt 0,2% (NH4 ) 2 S0 4 koncentráció viszonyok alakultak ki. Az elegy pH-ját 7,0-re állítottuk be. Az így nyert elegyet 50 ml-enként 500-as Erlenmayer lombikban steril körülmények között 4 órán át 28 C°-on rázattuk olyan rázóasztalon, melynek fordulatszáma 350 r/min, kitérése 35 0 mm volt. Az utókezelést a rázatás befejezése után végeztük, amikor is az elegyet 3 mm rétegvastagságban 15 percen át UV besugárzásnak vetettük alá (UV lámpa adatai: lásd 1. példában!) A besugárzás után kapott elegyből 2—2 ml-t 20X210 cm2 felületű, Blék üvegben elkészített szilárd táptalajra szélesztettünk. A szélesztményekből táptalajonként kifejlődött telepek száma átlagából kiszámítottuk, hogy a letalitás az utókezelésnél (az első kezelést túlélő spórák számához viszonyítottan) 75,9%-os volt. Az így nyert telepekből készített üzemi oltóanyagokat rázott kultúrában minőségi vizsgálatnak vetettük alá és azt találtuk, hogy az összes telep százalékában kifejezve a telepek utódai a kontrollhoz viszonyított termelőképesség szerint a következőképpen voltak osztályozhatók. Termelőképesség a kontroll %-ában Telepek száma az összes levizsgált telep %-ában 0— 30 7,0 30— 60 22,0 60— 90 35,0 90—100 17,3 100—110 12,7 110—220 (220%-os 1 db, ezután a legjobb 133%-os) A törzs egyetlen 220%-os mutánsából készített üzemi oltóanyag-sorozat egyes tagjait 600 literes keverős, rozsdamentes fermentorokban 1 :1 arányú levegőztetés mellett 3,0 % szorbitot, 5 2,0 % szójalisztet, 0,25% corn steep liquort, 0,2 % kalciumkarbonátot, 0,2 % nátriumkloridot, 0,1 % ammóniumszulfátot, 10 0,5 % napraforgóolajat tartalmazó steril táptalajokon 28 C°-on, 7,5 induló pH mellett 55 óra alatt inokulum fermentációvá növesztettük. Az inokulum fermentációkat 6 m3 -es keverős, 15 rozsdamentes fermentorokban elkészített 4 m3 az inokulum táptalajjal megegyező, steril táptalajba oltottuk és a fermentáció alatt 1 : 1 arányú 3,6 szulfitértéket jelentő levegőztetést biztosítottunk. A fermentációs táptalajok mennyiségéhez viszo-20 nyitottan, az inokulum fermentációk térfogata 10% volt. A fermentációk induló pH-ja 7,5 volt, a pH a fermentáció során fokozatos csökkenést mutatott, minimum 6-ig, majd fokozatosan emelkedett, maximum 8,4-ig. A fermentációk lefutása 25 alatt a hőmérsékletet 28 C°-on tartottuk. A fermentációk átlagos életkora 126 óra volt. Az előállított mutáns törzzsel elért fermentációk hozama (kinyert candicidin mennyisége) 3 fermentáció átlagát alapul véve a párhuzamosan 30 futott 3 kontroll fermentáció átlagánál 120%-kal volt magasabb. Szabadalmi igénypontok 35 1. Eljárás antibiotikumokat bioszintetizálo Streptomyces és Penicillium-fajok mustárnitrogén jelenlétében való mutagen kezelésére, majd fermentálására, azzal jellemezve, hogy az antibiotikum termelőképességet a mustárnitrogénes 40 kezelés után a fokozottan termelő törzsek számának feldúsításával oly módon fokozzuk, hogy a mutáció után a túlélő egyedek közül az intenzív kezdeti primer anyagcserével rendelkező egyedeket elöljük, majd az ily módon nyert biológiai ál-45 lományból szelektált törzzsel fermentálunk. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, amelyre jellemző, hogy a mutagen hatás alkalmazása után nyert biológiai állomány-50 ban a csírázás folyamatát a növekedés feltételeinek biztosításával beindítjuk, majd a kezdeti intenzív primer anyagcserével rendelkező egyedeket vegetatív alakká válásuk útján öljük el. 55 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, melyre jellemző, hogy az intenzív kezdeti primer anyagcserével rendelkező egyedeket UV sugárzással, mustárnitrogénnel vagy hőkezeléssel öljük el. (2 db rajz) A. kiadásért felel: a Közgazdasági és Jogi Könyvkiadó igazgatója 69.3767.66-42 Alíöldi Nyomda, Debrecen
