155443. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 6-19-oxido-androszt-4-én-3,17-dion előállítására
155443 lási anyag eltűnésekor a fermentációt alkalmas módon leállítjuk s a hasznos terméket, vagyis a 6,19-oxido-a;ndroszt^~én-3,17-diont a fermentléből kinyerjük. A mikroorganizmus növesztését 37 C°-on aerob körülmények közt végezhetjük. Kétnapos növekedés után a tenyészet eléri maximális szárazanyag-tartalmát és oldallánc-lébontó aktivitását. Ugyanakkor a tenyészet déhidrogenáz-aktivitása más táptalajokon növesztett tenyészetekéhez képest alacsony. Eljárásunk szemléltetésére szolgáló példáinkban. MFG és MKA2 táptalajt használtunk. E táptalajok összetétele a következő: MFG táptalaj: '1,5% kukoricalekvár, 1 %i glicerin, pH = 6,5—7,0 közé állítva. MKA2 táptalaj: 0,1% aszparagin, 0,1% KH2 P0 4> 0,5% glicerin, 0,1% nyomelem oldat, 1,0% kukoricalekvár felülúszó. „KukoricalekvárJfelülúszó" 10%-os kukoricalékvár oldat pH = 6,8—7,2 közé állítva, felforralva, majd szűrőpapíron szűrve. „Nyomelem-oldat" 1« iGaiCl2 10 mg C0NO3 88 mg ZnS04 3y 9 mg CuS04 1 mg NiS04 0,8 mg Na2 iB 4 0 7 0,72 img MnCl2 0,37 mg CNH4 )6Mo 7 0 24 1,0 mg Fe'S04 l-re i desztillált vízzel feltöltve. A szteroid átalakításának követésére a következő paplírkromatográfiás módszert alkalmaztuk : A fermentátum betöményített extraktumának mért hányadából 50—-100 jul-t cseppentettünk fel előzetesen túlfolyó kromatogram alakjában etilalkohollal mosott Macherey-Nagel 214 jelű papírra, melyet a feleseppentés előtt 30% propiléngiikolt tartalmazó metilalkohollal impregnáltunk. Mozgó fázisként propilénglikollal telített széntetraklorid és metilciklohexán 1 :1 arányú elegyét tartalmazó rendszert használtunk. Az elválasztás után a szteroidokat ultraibolya kontaktfotóval mutattuk ki, a megfelelő kivágott papírrészből a szteroidokat 10 ml p. a. tisztaságú alkohollal eluáltuk, majd megmértük az eluátum extinkciőját 238 m/n-nál. A megfelelő vakérték levonása után standard görbéről leolvastuk az oldat szteroid-tartalmát. A találmány szerinti eljárás foganatosítására az alábbi kiviteli példákat adjuk meg. 10 15 20 25 Í0 Z5 40 45 50 55 60 65 1. példa: Mycobacterium phlei egyhetes, burgonyás ferdéagaron nőtt tenyészetéből 8 ml steril desztillált vízzel szuszpenziót készítettünk és ebből 1 iril-rel oltottunk 100 ml MFG jelű steril táptalajt 500 ml-es Erlenmeyer-lombikban. A beoltott lombikokat 37 C°-os termosztát-szobában rázatva inkubáltuk 48 óra hosszat. A kapott tenyészet (továbbiakban „MFG tenyészet") 5 ml-ével oltottunk 100 ml MKA2 jelű steril táptalajt 500 ml-es Erlenmeyer lombikban. Ezeket a lombikokat is 37 C°-os termosztátszobában rázatva inkubáltuk 48 óra hosszat, majd az így kapott tenyészet 100 ml-éhez 60 mg 6,l! 9-oxido-koleszt-4-Jén-i3-ont adagoltunk s a lombikokat tovább rázattuk 37 C°-on. Az átalakítást papírkromatográfiás méréssel követtük, az eredményeket az 1. táblázatban közöljük. 1. sz. táblázat Tenyészet kora órákban A tenyészet 6,!l9 -oxido-androszt-4-én tartalma /xg/'ml-ben 0 12 24 48 0 145 240 303 Mint a táblázatból látható, kb. 48 óra eltelte után a beadagolt szubsztrátum nagyrészben 6;, 19-oxido-androszt-4-én-3,17-dionná alakult. 2. példa: Mycobacterium lacticola, illetve Mycobacterium smegmatis egyhetes, burgonyás ferdéagaron nőtt tenyészetéből 8 ml steril desztillált vízzel szuszpenziót készítettünk és ezekből 1—1 ml-rel oltottunk 100 ml MKA2 jelű steril táptalajt 500 ml-es Erlenmeyer-lombikban. A lombikokat 37 C°-os termosztát-szobában rázatva inkubáltuk 48 óra hosszat. Ezután lombikonként 60—60 mg 6,i 19-oxido j koleszt-4-én-3K)nt adagoltunk és folytattuk, az inkubálást. Az átalakítás követésének papírkromatográfiás eredményeit a 2. táblázatban foglaltuk össze. 2. táblázat A férmentlé 6,19-oxido-androszt-Tenyészet -4-én-3,17-dion tartalma kora jttg/ml-ben órákban Mycobacterium Mycobacterium lacticola smegmatis 0 0 0 24 105 105 48 146 246 72 190 220 1
