155123. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szteroidok mikrobiológiai előállítására
3 155123 4 ^^^^HRt baktériumok behatásának vetettek ^^^Hal a icéllal, hogy így ösztront állítsanak ^^H^t találták, hogy a Nocardia és Mycobac^fmm nemekhez tartozó mikroorganizmusok ezt az anyagot nem alakítják át. Másrészt azonban a 19-hidtroxi-4-koleszténH3-ont ezek a mikroorganizmusok könnyen átalakították ösztronná, a 6,il9-oxidtM4-,kolesztén-3-ont pedig 6,19--oxido-4-androsztén-i3,il7-dionná. Azt találtuk, hogy a 17-thelyzetben széntartalmú helyettesítőt nem tartalmazó szteroidokat lehet előállítani a 17-helyzetben legalább 8 szénatomos telített vagy telítetlen gyököt tartalmazó szteroidok mikrobiológiai átalakítása útján, a Mycobacterium-nemhez tartozó mikroorganizmusok segítségével, ha a mikrobiológiai konverziót szervetlen inhibitor jelenlétében folytatjuk le. A találmány szerinti eljárásban oly szteroidokból indulunk ki, amelyeknek a gyűrűrendszerét a mikrobiológiai konverzió egyébként megtámadja. Az eljárás alkalmas kiindulóanyagainak példáiként a következő, a 17-helyzetben oldalláncot tartalmazó 3-keto- ill. 3-hidroxi-szteroidok említhetők: koleszterin, béta-szitoszterin, sztigmaszerin, 4-jkolesztén-3-on. Alkalmazhatók kiindulóanyagokként az ilyen szteroidok származékai, pl. a megfelelő észterek, mint koleszteril-betain-klorid, koleszteril-acetát vagy koleszteril-hemiszukcinát, továbbá addíciós termékek, mint az 5a-klórkolesztanol, továbbá az olyan szterolok is, amelyek az A-gyűrűben egy vagy több további helyettesítőt tartalmaznak. E konverzió lefolytatására mikroorganizmusként a Mycobacterium-nemhez tartozó organizmusok, mint Mycobacterium phlei vagy Mycobacterium butyricum alkalmazhatók. Inhibitorként, a szteroid-gyűrűrendszer lebomlásának gátlására és a megfelelő angularis metilosoportok érintetlenül maradásának a lehető legnagyobb mértékű biztosítására bizonyos szervetlen ionok, mint pl. nikkel-, kobalt-, ólom-, kadmium- és szelenit-ionok alkalmasak. A találmány szerinti eljárás egyik célkitűzését oly szteroidok előállítása képezi, amelyek vázukban 19 szénatomot tartalmaznak, amelyek együttesen alkotják a dimetilciklopentanoperhidrofenantrén-vázat; különösen pedig az 1,4--and!rosztadién-'3,17-dion és 4-androsztén-3,17--dion előállítása képezi a találmány elsőrendű célját. A 17-íhelyzetbeli keto-csoport Zimmerman-ireakcióval könnyen kimutatható, ha a 16-helyzetű szénatomon nincs helyettesítő (vö. W. Zimmermann, Hoppe Seylers Z. Physiol. Chemie 233, 257, 1935). Az androsztadiéndion értékes termék, mert kiindulóanyagként használható számos androgen, ösztrogén, anaboliás és fogamzásgátló hatású vegyület előállítására. A találmány szerinti eljárás többek között lehetővé teszi a természetben előforduló és önmagában csak korlátozott mértékben felhasználható koleszterin nagyértékű közbenső termékké való átalakítását. A találmány szerinti eljárás helyes alkalma-5 zása céljából szükséges, hogy a Mycobacteriumtörzset oly tápközegben szaporítsuk, amely szervetlen, vagy szerves nitrogénforrást, mint aminosavakat, ammóniumsóikat, alkálinitrátokat, alkáliföldfém-nitrátokat vagy peptont tartal-10 maz; igen jó nitrogémforrás a kukoricalekvár, élesztőkivonat, gyapotmagliszt, szójaliszt, cefresűrítmény és hasonlók is. A tápközegnek asszimilálható szénforrást, mint cukrokat, keményítőt vagy többértékű alkoholt nem kell tartal-15 máznia, 'bár ilyenek jelenléte az eljárás során zavaró hatást nem fejt ki. Emeltet a megfelelő tápközegnek a szokásos mennyiségben sókat, pl. alkáli- vagy alkáliföldfém-ífoszfátokat, szulfátokat vagy kloridokat is tartalmaznia kell. 20 Vízvezetéki víz alkalmazása esetén a szokásos nyomelemek kellő mennyiségben való jelenléte már biztosítva van. Ha természetes nitrogénforrásként valamely bonyolult szerkezetű elegyet, mint kukorica-25 lekvárt alkalmazunk, akkor a szervetlen sók külön hozzáadása rendszerint mellőzhető. A tápközeget a szokásos módon sterilizáljuk; e kezelés után pH-értékű 4,0 és 8,5 között, rendszerint 7,0 körül lehet. SO Ha az ilyen tápközegben, állandó szellőzés mellett a sejtek már kellően elszaporodtak, hozzáadjuk a szteroidot, pl. koleszterint vagy béta-szitoszterint, vagy valamely alkalmas oldószerben, pl. N,N-dimetilformamidban oldott állapotban, vagy pedig vízben finoman szuszpendált alakban. A hozzáadandó inhibitor mennyisége a körülményektől függ. Ha az inhibitor koncentrációja túlságosan alacsony, akkor a szteroid teljesen lebomlik alacsony molekulasúlyú vegyületekké. Ha viszont túlságosan nagy az inhibitor ^koncentráció, akkor a szteroid konverziója túlságosan messzemenő gátlást szenved és a mikroorganizmusok el is pusztulhatnak. Ha NiS04 -7H 2 0 kerül inhibitorként alkalmazásra, akkor elegendő 10—4000 mg/liter koncentrációt alkalmazni, bár adott körülmények között en-50 nél alacsonyabb vagy magasabb koncentráció is kívánatos vagy megengedhető lehet. Kobaltklorid, ólomacetát, kadmiumszulfát vagy nátriumszelenit inhibitorként való alkalmazása esetén a megtfelelő koncentrációk szintén a fent 55 említett határok közé esnek, A szteroidokat 0—7'2 órával az inokulálás után adhatjuk a tápközegihez, bár későbbi hozzáadás esetén is elfogadható eredményeket érhetünk el. Előnyös azonban, ha a szteroidot a 60 kultúra beoltása után 24—48 órával adjuk a tápközeghez, minthogy ekkor a baktériumok már kellő mértékben elszaporodtak. Az igen korai, pl. közvetlenül az inokulálás utáni hozzáadás lehetősége sincs azonban kizárva. Az 6g inhibitort általában a szteroiddal egyidejűleg 2
