154657. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új ACTH-hatású peptidek előállítására
9 154657 10 3 óra hosszat keverjük 50°-on, ismét ugyanennyi diciklohexil-karbodiimidet adunk hozzá és újból 3 óra hosszat keverjük 50°-on, majd félszilárd maradék képződéséig bepároljuk. A peptideket 20 ml dimetilformamiddal való melegítés útján oldjuk és szűréssel elkülönítjük a nem oldódó diciklohexilkarbamidtól. A szűredéket sűrűnfolyó maradék képződéséig bepároljuk, majd 50 ml vizet adunk hozzá, amikoris egy kenődő konzisztenciájú termék válik ki, ezt elkülönítjük az anyalúgtól és megszárítjuk. Dimetilformamid, metanol és etilacetát elegyéből történő kétszeri átkristályosítás után 1,29 g nyers terméket kapunk, ezt végső tisztítás céljából Craig-mégosztásnak vetjük alá metanol-tompító^kloroform-széntetraklorid 10 : 3 : 7 : 4 arányú elegyéből álló oldószer-rendszerrel, 10— 10 ml fázis-térfogattal (tompító: 28,5 ml jégecet +19,25 g amimóniumacetát 960 ml vízben). A művelet megkezdésekor az anyagot egyenletesen elosztva töltjük be a készülék első öt elemébe. 171 fokozat után az 50—74. elemből (v max = 62; K = 0,57) különítjük el a terméket, szárazra történő bepárlás és az ammóniumacetát 40° hőmérsékleten nagyvákuumban történő* kiszublimálása útján. Vékonyrétegű kromatográfiával egységesnek mutatkozó védett oktadekapeptid-amidot kapunk tiszta, amorf por alakjában, amely kb. 210—225°-on bomlás közben olvad. Szilikagélen az alábbi R/-értékeket kapjuk: 10 20 25 Alumíniumoxidon történő vékonyrétegű kromatografálással az alábbi R/-értékeket kapjuk: R/ (52A) R/ (101) = 0,13 = 0,32 Papnvelektroforézissel (16 volt/cm, pH =6,1, piridinacetát-tompítóval) a vegyület 2 óra alatt 11,5 cm-t vándorol a katód felé. 2. példa: Szárazampullákba kiszerelt készítményt állítunk elő az alábbi alkotórészekből (a megadott 15 mennyiségek 1 ampullára vonatkoznak): D-Seri-Lys^-iS-yji-is^kortikotropin-Lys18 -amid-acetát ZnS04 -7 H 2 0 Na3 P0 4 -12 H 2 0 mannit 0,5 mg 1,23 mg 1,38 mg 40,0 mg Felhasználás előtt a szárazampulla tertalmát egy oldószer ampullába kiszerelt 1 ml desztillált vízzel elegyítjük. Az így kapott szuszpenzió pH-értéke 7,6. 3. példa: Szárazampullákba kiszerelt készítményt állítunk elő az alábbi alkotórészekből (a megadott mennyiségek 1 ampullára vonatkoznak): R/ (kloroform-metanol = = 75 : 25) = 0,51 D^Seri-Lys^.ia-^-^-kortikotropin-K/ (43C) = 0,62 -Lys18 -amid-acetát 0,5 mg R/ (52) = 0,55 35 ZnS04 -7 H 2 0 1,23 mg R, (100) = 0,43 mannit 40,0 mg A kiindulóanyagként felhasznált dekapeptid-származék előállítását a törzsszabadalomban írtuk le. 40 6. H-D-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-PheJArg-Try-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Lys-Lys-NH2 (D-Serí-Lys"-i8-^i-i8-kortikotropin-Lysi8-^amid) 45 400 mg fenti módon előállított védett oktadekapeptidamidot 8 ml 90%-os trifluorecetsavban oldunk és az oldatot 30 percig állni hagyjuk 25° hőmérsékleten. Ezután kb. 3 ml térfo- 50 gátra pároljuk be, 20 ml vizet adunk hozzá, ismét bepároljuk és liofilizáljuk. Az oktadekapeptid-amid így kapott tr if luor acetát ját acetáttá történő átalakítás céljából kevés vízben oldjuk és lassan átszűrjük egy 11 mm átmérőjű, 16 cm 55 hosszú, acetát-alakban levő gyengén bázisos ioncserélővel (pl. Merck Nr. II) töltött oszlopon. Az eluátumot kis térfogatra pároljuk be, liofilizáljuk és nagyvákuumban, 40° hőmérsékleten még tovább szárítjuk. Ily módon 301 mg kro- gg matofráfiailag és elektroforézissel is egységesnek mutatkozó D-Seri-Lys^iS-yS^Miortikotropin-Lys18-amid-acetátat kapunk, kb. 170—180°on bomló amorf fehér por alakjában (nem éles bomlásponttal). 6 5 Egy oldószerampullában az alábbi összetételű oldatot szereljük ki: Na3 P0 4 -12 H 2 0 Versene Fe-3 desztillált vízzel feltöltve 1,38 mg 0,1 mg 1,0 ml-re. Felhasználás előtt á szárazampulla tartalmát elegyítjük az oldószerampulla tartalmával. Az így kapott szuszpenzió pH-értéke 7,6. 4. példa: Egy ampullába az alábbi alkotórészekből álló oldatot szereljük ki: D-Seri-Lys^^-ySi-^kortikotropin--Lys 18 -amid-acetát zselatin fenol desztillált vízzel feltöltve 5. példa: 0,5 mg 280,0 mg 5,0 mg 1,0 ml-re. D-Ser1 -Lys 17 ' 18 -/3 1_18 -kortikotropin-Lys 18 -amid-acetát sterilre szűrt vizes oldatát aszeptikus körülmények között elegyítjük nátrium-poli-5
