154641. lajstromszámú szabadalom • Eljárás egy aszpergillopeptidáz előállítására

11 154641 12 ban gyűjtöttük össze, A frakciók extinkcióját 280 m/* hullámhosszon határoztuk meg. Közvetlenül az oszlop ürestérfogatának megfelelő folyadékmennyiség után csúcsot kaptunk. Az éhhez a csúcshoz tartozó valamennyi frakciót 5 összegyűjtöttük, és forgó vákuumbepárlóban eredeti térfogatuk 1/5-ére koncentráltuk. Ezt az oldatot azután felvittük egy kb. 27 g, 0,04 mólos foszfátpufferral 6,80 pH-nál egyensúlyba hozott Sephadexet tartalmazó oszlopra (ennek az 10 oszlopnak 500 Ö00 molekulasúlyú kékre színezett Dextrah-származékkal meghatározott ürestérfogata kb. 40 ml volt, a glukóz eluálási térfogata pedig kb. 135 ml). Az oszlopot a 0,04 mólos pufferral eluálva az aszpergillopeptidáz ARL 1 15 60—80 ml-nél jelént még; Valamennyi frakciót megvizsgáltunk antigén tulajdonságokra. Egy kísérletsorozatban az elválasztott aszpergillopeptidáz ARL 1 aránya 0,5—2,0% között változott. 20 Egyes esetekben a gélszűrést elhagytuk, és még így is sikerült tiszta aszpergillopeptidáz ARL 1-et kapni. Ilyen esetékben az oldatot a hidroxilapatit-oszlopra ;való felvitele előtt dializáló csővel dializáltuk. 16 órai dializálás után 25 az oldatot felvittük a hidroxilapatit oszlopra, és a fent leírt módon kezeltük. Hosszantartó és erőteljesebb dialízis a koncentrációt nullára csökkentheti. 30 Hasonló eredményeket kaptunk, amikor kereskedelmi kalciumfoszfátot, (Richmond, Calif., USA) használtunk a fenti hidroxilapatit készítmény helyett. 35 4. példa: Két Sephadéx G:50 Fine oszlopot 8 cm2 keresztmetszettel és 47, illetve 93 hosszúsággal felszereltünk regisztráló abszorbcióméterekkel. Az oszlopokat egyensúlyba hoztuk, majd eluáltuk literenként 9 g nátrmmkloridot tartalmazó 0,001 mólos foszfátpufferral 6,80 pH-nál. Miután a két oszlopot összekötöttük, úgyhogy a kisebb oszlopból távozó folyadék a nagyobb oszlopra jutott, a kisebb oszlopra felvittünk a 3. példa szerinti kiindulási anyagból 302 mg-ot 4,9 ml pufferban oldva. Amikor az első abszorbcióméter 3 „nagy molekulasúly" csúcsot jelzett, a két oszlop kapcsolatát megszakítottuk, és a nagy molekulasúlyú összetevőket eluáltuk a nagyobbik oszlopról 3 jól elkülönített csúcs alakjában. A harmadik csúcsot létesítő aszpergillopeptidáz ARL 1 azonosságát immunodiffúzióval állapítot-« tuk meg. 5. példa: Aspergillus oryzae folyékony tenyészetéből származó csersavval kicsapott proteáz keveréket 5,5 pH-nál karboximetilcellulózzal kezeltünk. A karboximetilcellulózról 0,005 mólos ammóniumacetát pufferral 7,5 pH-nál egy nyers keveréket eluáltunk. A termék egy A enzimkeverék (lásd 1. példa). Ebből származó 30 mg száraz porkészítményt feloldottunk 3 ml pufferban, 17 óra hosszat dializáltuk Visking dializáló csőben, majd rávittük egy ugyanolyan méretű hidroxilapatit oszlopra, mint a 3. példában, amelyet előzőleg 0,001 mólos foszfátpufferral 6,80 pH-nál egyensúlyba hoztunk, majd eluáltunk. Az ürestérfogatnál egy kis, feltehetően kis molekulasúlyú'összetevő jelent meg, ezt közvetlenül követte az aszpergillopeptidáz ARL 1. Az enzimet tovább tisztítottuk és deionizáltuk 0,2—0,5 mm finomságú gélszűrőn. A 2 x 109 cm méretű oszlopot deionizált vízzel 30 ml/h áramlási sebességgel eluáltuk. A főcsúcs középső részét összegyűjtöttük és liofilizáltuk. Színtelen port kaptunk 1,5% hozammal. Amikor a fenti karboximetilcellulózt koncentráltabb, 0,01—0,1 mólos ammóniumacetát pufferral eluáltuk, lényegesen nagyobb aszpergillopeptidáz ARL 1 tartalmú száraz porkészítményeket kaptunk, bár kisebb mennyiségekben. 6. példa: , A 4. példát megismételtük, de A enzimkeveréket használva a 4. példában használt kiindulási anyag helyett. A hozam legalább egyenlő volt a 4. példában elérttel. 7. példa: Egy 0,1—0,2 mm szemnagyságú Amberlit CG:50 II oszlopot egyensúlyba hoztunk, majd eluáltunk egy 0,01 mólos foszfát-pufferral 7,50 pH-nál. Az 5. példában a karboximetilcellulóznak 0,01 mólos amimóniumacetát-pufferral 7,5 pH-nál való második eluálása során kapott eluátumból készült 58 g száraz porkészítményt feloldottunk 1 ml 0,01 mólos, 7,50 pH-jú foszfát-pufferban, egy napig dializáltunk 500 ml ilyen pufferral szemben, és felvittünk az oszlopra. Az üres térfogat 3—4-szeresét kitevő eluálási térfogatnál elkülönítettük az aszpergillopeptidáz ARL 1-et. A terméket immunodiffúzióval azonosítottuk. A hozam több mint 30 súly%-a volt az alkalmazott teljes mennyiségnek. 8. példa: Aspergillus oryzae folyékony tenyészetéből származó csersavval kicsapott proteáz keverékből 1 g-ot 4 g Celit 535-tel együtt szuszpendáltunk 10 ml 0,001 mólos foszfátpufferban. A pH eközben 5,5-re változott. Ezt a szuszpenziót felvittük egy 0,001 mólos foszfátpufferral egyensúlyba hozott hidroxilapatit oszlopra, majd az oszlopot fokozatosan növekvő koncentrációjú 6,80 pH-jú foszfátpuffereral eluáltuk. A 280 nví-nál abszorbeáló összetevőknek csak részleges elválasztását sikerült elérni. Immunodiffúzióval azonosítottunk minden oszpergillopeptidáz ARL 1-et tartalmazó frakciót. Ezeket a frakciókat összegyűjtöttük, és forgó vákuumbepárlóban 13 ml térfogatra koncentráltuk. A koncentrátumot felvittük egy kis hidroxilapatit 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60