154641. lajstromszámú szabadalom • Eljárás egy aszpergillopeptidáz előállítására
3 154641 4 Antikoagulánsokkal, például heparin- vagy kumarinszármazékokkal történő gyógykezeléssel a másodlagos folyamat — a plazmakoaguláció — megakadályozható, de ez nem érinti a lemezkék ragadósságát és tömörülését. Eszerint a trombózisos elzáródások, nevezetesen a szívkoszorúértrombózis elhárítására a lemezkék tömörülésének megakadályozása fontosabb, mint a vér koagulásának meggátlása. Azt tapasztalták, hogy számos betegség során, valamint nagysebészeti műtét és szülés után fokozódik a lemezkék tömörülése és ezzel a trombusok és embolusok képződésének veszélye., tehát nagyon nagy gyakorlati értéke lenne egy olyan vegyületnek, amely - csökkenteni képes a szokatlanul nagymérvű lemezketömörülést. Eddig ilyen klinikailag hatásos gyógyszer nem állt rendelkezésre. A találmány célja tehát egy olyan anyag, illetve készítmény előállítása, amely alkalmas trombusok és embolusok képződésének megakadályozására a vérlemezkék ragadósságának és tömörülésének csökkentése révén. Ezt a célt az alább ismertetett, eddig ismeretlen aszpergillopeptidázzal érjük el. Egy aszpergillopeptidáz, a „proteáz I" előállítását, elkülönítését és jellemzését Bergkvist közli [Bergkvist, R.: Acta Chem. Scand. 17, 1521, 2230 és 2239 (1963)]. Ezt az enzimet egységes proteinnek tartották, amely fibrinolitikus hatása révén felhasználható vérrögök szétoszlatására. Ügy vélték, hogy ez az enzim lényegében nem hat a vér vagy a plazma összetevőire. Nem képes azonban a vérlemezkék ragadósságát megszüntetni vagy tömörülésüket megakadályozni. Mármost mi azt találtuk, hogy a Bergkvist által leírt módszer módosításával olyan enzimkészítményhez juthatunk, amely az említett proteáz I-gyel ellentétben kér:es a vé-lsmerkéh r.í • gadósságát csökkentem és törne rülésvket megakadályozni, elhárítva ezáltal a trombüsképződés veszélyét. Ezt az új enzimet úgy állíthatjuk elő, hogy az Aspergillus oryzae folyékony tenyészetéből kicsapott protázkeveréket (Bergkvist ugyanott, 1537) csersavval kezeljük, majd az újra feloldott terméket 5,5 pH-nál karboximetilcellulózon adszorbeáltatjuk, és foszfátpuffer helyett 7,5 pH-s 0,005 mólos ammóniumacetát-oldattal eluáljuk. Egyszerűség kedvéért az ebből az eluátumból kapott száraz porkészítményt a továbbiakban „A enzimkeveréknek" fogjuk nevezni. Az A enzimkeverék a proteáz I-gyel szemben mutatkozó fiziológiai enzimgátlás szintje alatti koncentrációkban fejti ki hatását. A kérdéses koncentrációnál nincs szabad fibriolitikus hatás, és nem észlelhető a vér normális koagulációs rendszerére gyakorolt káros befolyás sem. Ilyen körülmények között az A enzimkeverék klinikai eltűrhetősége kiváló. Tekintettel az enzimkészítménynek erre az új ragadást és tömörülést gátló képességére további kísérleteket végeztünk, és immunológiai módszerekkel — immunodiffuzió. és immunoelektroforézis útján — kimutattuk, hogy a készítmény keverék, és hogy további összetevőkre bontható szét, amelyek közül az egyik, az aszpergillopeptidáz ARL 1 a vérlemezkékre gyakorolt hatás forrása, a többi összetevő el-5 lenben gyakorlatilag hatástalan. Ez az új enzim egyéb aszpergillopeptidáz-készítményekből is elkülöníthető. A találmány értelmében előállított aszpergillopeptidáz ARL 1 tulajdonságaiból arra lehet 10 következtetni, hogy a terméknek meghatározott kémiai összetétele van, de csekély ingadozások esetleg lehetségesek. Az aszpergillopeptidáz ARL l-re a következő tulajdonságok jellemzők: a) egységes összetételű protein; 15 b) könnyen oldódik vízben, sóoldatban és a szokványos pufferolt oldatokban; c) állandó és megtartja enzimes hatékonyságát szobahőmérsékleten száraz por alakjában több, mint 1 évig; 20 d) állandó közelítőleg semleges vizes oldatokban 4 C°-on gyakorlatilag az enzimes hatékonyság csökkenése nélkül több mint 2 hónapig; e) állandó közelítőleg semleges vizes oldatokban 37 C°-on enzimes hatékonyságának csök-25 kenése nélkül több mint 24 óra hosszat; f) ultraibolya elnyelési színképe az aromás aminosavakat tartalmazó proteinekre jellemző; g) proteolitikusan hatékony kazeinre, hemoglobinra és fibrinre; 30 h) hemoglobin esetében a proteolízis optimuma 5,0—5,5 pH-nál van; i) nem képes hidrolizálni a nátrium-tozil-L-arginin-etilésztert és az N-acetil-L-tirozil-etilésztert; .3.5 j) csökkenteni képes a vér lemezkék ragadósságát és tömörülését; k) karboximettícellulózon 5,5 pH-nál adszorbeálódik; 1) a karboximetilcellulózról 7,5 pH-ra puffe-40 rolt, legalább 0,005 és előnyösen 0,01—0,10 mólos vagy töményebb ammóniumacetát-oldattal eluálható; m) kromatografálás során a 0,01 mólos 7,5 pH-s foszfátpufferral egyensúlyba hozott és 45 eluált Amberlit CG:50 II ioncserélő műgyanta visszatartja; n) 0,001 mólos, 6,8 pH-s foszfátpufferral egyensúlyba hozott és eluált hidroxilapatit-osz•lopon számottevő adszorbeálódás nélkül áthalad; 50 o) gélszűrés közben Sephadex G:50F (Dextran alapú gélszűrő készítmény) úgy késlelteti, hogy az eluálási folyadékban a glukóz eluátuma és az 5-105 molekulasúlyú Dextran eluátuma közötti távolság egyharmadánál jelenik meg a 55 maximuma (v. ö. a 3. példával); p) a gélszűrés alapján a molekulasúlya kisebb, mint a proteáz I aszpergillopeptidázé, amelynek az ultracentrifugálással meghatározott molekulasúlya 20 000—30 000. 60 Az állatok, beleértve az embert, trombusok és embolusok keletkezését megakadályozó kezelésére alkalmas gyógyászati készítmények előállítási eljárása a következő lépésekből álló művelet : 65 a) aszpergillopeptidázoknak lehetőleg előtisz-2
