154495. lajstromszámú szabadalom • Eljárás marhatüdőből nyert nyers proteáz-inhibitorkészítmények tisztítására

3 154495 4 Az összes említett eljárásoknak vannak azonban fogyatékosságai. Mint a ballasztanyagok kicsapásán, mint pedig a hatóanyag kicsapásán alapuló eljárás után a kicsapószert az oldatból kvantitatíve el kell távolítani, ami jelentékeny 5 ráfordítást igényel. Az anioncserélőkkel való dolgozás különösen nagy megterhelést jelent, mert lúg felvitele után ezeket nagymennyiségű kétszer desztillált vízzel kell kimosni. Ebből kifolyólag az ion- io cserés eljáráshoz viszonylag nagymennyiségű ioncserélő szükséges. A membrándialízis és még inkább a térhálós dextrángélen történő szűrés nagyüzemi gyártásra nem alkalmas. Az ezekkel a módszerek- 15 kel együttjáró hosszabb kezelési idő a mikroorganizmus fejlődésének kedvez és ezáltal a pirogén anyagok keletkezését élősegíti. Ezáltal az inhibitoroldat terápiás felhasználásra alkalmatlanná válik. 20 A jelen találmány célja az eljárás fenti hátrányainak a kiküszöbölése. A találmány feladata olyan adszorbens alkalmazása, amely a nyers inhibitor oldatban levő kísérő fehérje- 2

5 ket és színezőanyagokat megkötni és ezáltal az oldat tisztítását elősegíteni képes. Emellett ügyeini kell arra, hogy az adszorpció vagy zárvány útján előálló hatóanyag-veszteség minimális legyen. ?0 Az eljárásnak nagyüzemileg könnyen kivitelezhetőnek kell lennie, és kevés műveletből kell állnia. Azt találtuk, hogy a proteáz-inhibitornak marhatüdőből klinikai alkalmazásra jól elvisel- 5 hető, tiszta készítménye állítható elő a következő módon: Milliliterenként 800—1300 anti-tripszin-egység (ATrE) aktivitással és 8,5—9,5 pH-értékkel rendelkező, marhatüdőből nyert inhibitor tiszti- ^ tatlan vizes oldatához 3—10, előnyösen 5% tiszta magnéziumoxidot (MgO) adunk és 1—16, előnyösen 3 órán át 10—50 C°, előnyösen 25 C° hőmérsékleten mechanikai úton keverjük. A proteineket és színezőanyagokat adszorbeált magnéziumoxidot szívószűrőn elkülönítjük. A kezdetben sárgás barnás színű inhibitoroldat eközben csaknem színtelen lesz. A proteinek adszorpcióját igazolja a relatív extmkcióértéknek ultraibolyában, 280 nm-en 5Q mért csökkenése, a kiindulási, ill. a magnéziumoxiddal kezelt oldatban mérve. A pigmentek eltávolítását az extinkciónak 555 nm-en történő mérésével ellenőrizhetjük. A magnéziumoxidnak adszorbeáló anyagként '_ való alkalmazása bár ismert, mégis igen meglepő a proteinekkel szemben mutatkozó szelektív adszorpciós képessege mely a viszonylag alacsonymolekulájú polipeptidekre, mint amilyen a proteáz-inMbitor nem vonatkozik. Az alkáliföldfémek csoportjába tartozó többi fémek oxidjai, így a kalcium és bárium oxidjai a magnéziuméhoz hasonlóan proteaz-inhibitorok tisztítására nem alkalmasak, még ha elvi- 65 leg ugyanazokkal a képességekkel rendelkeznek is. A sok más, vizsgálatnak alávetett adszorbens a hatóanyagot túl nagymértékben, vagy a ballasztanyagok eltávolítását túl kismértékben végezte. A magnéziumoxid a ballasztanyagokon kívül csak mintegy 10% hatóanyagot adszorbeált. A szennyezőanyagokat tartalmazó MgO-nak szívószűrőn történő, eltávolítása után a hatóanyag oldat még magnézium-ion nyomokat tartalmaz, melyek bár biológiai szempontból jelentéktelenek, adott esetben polimerizációs-gyanta típusú kationcserélővel keverve eltávolíthatók. A gyanta divinilbenzollal térhálósított polisztirol alapú polimerizátum. Az ioncserélő szívószűrőn történő eltávolítása után a nyert szűrletet 2—6-szoros, előnyösen 4-szeres térfogatú alacsony alifás alkohollal, előnyösen etanollal, vagy acetonnal elegyítjük. A kicsapószert ezt megelőzően célszerű —5 C°ra lehűtjük, és a keveréket a hatóanyag teljes kiválása céljából éjszakán át hidegen tartjuk. Tiszta fehér, finom csapadékot kapunk, amit az oldattól célszerűen centrifugálással elválasztunk. A csapadékot etanollal, ill. acetonnal mossuk és így száraz porrá feldolgozzuk, vagy pirogén anyagoktól mentes vízben, ill. fiziológiás konyhasó oldatban felvesszük, amikorís maradék nélkül oldódik. Ennek a 2,5—3,5 pH-értékkel rendelkező inhibitor oldatnak az aktivitása kb. 2500 ATrE/ml. A hozam a bevitt anyagra számítva 80—95%A kiindulási oldat 80—140 ATrE/mg tisztasági foka a végtermékben SOO—1000 ATrE/mgra nő. Az inhibitor oldat az ismert módon sterilizáló szűrésnek vetjük alá. Ezt követően terápiás célra minden további nélkül alkalmazható. A találmány szerinti eljárással előállított inhibitor oldatban sem proteinek szulfoszalicilsavval, sem magnéziumionok az érzékeny titánsárga reakcióval nem mutathatók ki. A marhatüdőből nyert proteáz-inhibitor aktivitását antítripszin egységekben ^ATrE) adjuk meg. Ennek meghatározására a Markwardt és Walsmann által leírt módon történik. [F, Markwardt, P. Walsmann: Zur quantitativen Bestimmung von Proteasen Inhibitoren, Die Pharmazie, 19, 453 (1964-)] A találmány szerinti eljárás kiviteli módját közelebbről az alábbi példa szemlélteti. Példa: 918 ATrE/ml aktivitású, marihatüdőből nyert, inhibitor oldat 650 ml-ét kb. 8,5 pH-értéken, 32,5 g magnéziumoxiddal elegyítünk és 3 órán át 25 C°-on mechanikai úton keverjük. Ezt követő, szívószűrőn elkülönítjük. és így 580 ml, 774 ATrE/ml aktivitású, 10,0 pH-értékű inhibitor oldatot nyerünk, miközben az oldat 280 nm-2