154416. lajstromszámú szabadalom • Peptidzerű tripszin-inhibitor, és eljárás annak előállítására
3 154416 4 vörös spektrumot, a 2. ábra az ultraibolya spektrumot mutatja. Inhiibitáló viselkedés enzimekkel szemben: Fajlagos aktivitás: 3,0 ErnU/mifcrogramim. protein, ahol 1 ImU 2 miferamól szubsztrátum (N -ibenzoil-Dlnarginin-p-nitroanilid) tripszinnel katalizált átalakulását percenként 25 C°-on 1 mifcromólra csökkenti. Az anyag -inlhibitálja továbbá a növényi enzimek csoportjába tartozó papaint. Nem, inhiibitált anyagok: Kimotripszin (észterolizis és proteolizis), fcallikrein (észterolizis és vérnyomása-csökkentés kutyáknál), tromíbin {észterolizis és a teljes vér vagy a vérplazma kicsiapása) és plazmiin (észterolizis és proteolizis). Az új inhibitor hasznos anyag gyógyászati készítményekben, pl. tripszin és egyéb enzimek inhibitálására, és e célból vizes vagy másmilyen oldatot állítunk elő adagolás 'Céljára, pl. injektáláshoz, ahol az inhibitor gyógyászatilag hatékony mennyiségben van jelen az inert hordozóban, amely a készítmény fő részét képezi. A találmányt az alábbi példával szemléltetjük, az oltalmi kör korlátozása nélkül. Példa: 10 kg disznó-foasnyálmiirigyet homogenizálunk 10 1 <3%-os perklórsawal, és rövid időre 60 C'0 -ra melegítjük a homogenizátumot. Lehűlés után az oldatlan komponenseket centrifugálással elkülönítjük, és a tiszta felülúszó részt semlegesítjük 2,5%-os K^OOs-oldattal. Ez a kiindulási oldat összesen 1,S g triiipszint képes inaktíválni, ami 3 000'000 tripszininaktivátor egység i(TIU) tartalomnak felel meg. (1 TIU 1 gamma tripszin 50%-át inhíbdtálja). A kicsapódott KC104 -et szűrjük, és a szüredéket rotációs vákuum-bepáirlóíban erősen betöményítjük. A kicsapódott sókról az oldatot dekantáljuk. A koncentrátumot 70 ml-es részletekben sómantesítjük Sephadex-G-25 kolonnán (5x200 om). líoifilizáljuk. Ilyen módon az inhibitor 800-szoros tisztítását érhetjük el. Ekkor az inhibitor tisztasága 0,22 rniilkrogramm (TIU). A fciterimelés 54<>/o. További tisztítás céljából tömény tripszin-oldat egy mennyiségét (7,8-as pH-ju 0,1 m pufférrel készítve) adjuk a fenti inhibitor-oldathoz úgy, hogy kis mennyiségű inhibitor még kötetlen maradjon. Ezután a tripszin-inlhibitor komplexet Sepha-dex-G-BO1 kolonnán frakcionáljuk. A frakciók inhibitor-tartalmát úgy határozzuk meg, hogy a szüredéket proteinmentesítjülk, és meghatározzuk a szüredék inhiibitáló hatását tripszinre .vonatkoztatva. Az eluált inhibitor-űtoimplex liofilizálás • után tripszin-frakcióra és inhibitor-frakcióra hasad 0,01 n HCl-lel végzett ekvilibráltatás után Sephadex-G-50 kolonnán. A tiszta inhibitort liofiiizálással és Sephadex-G-25 kolonnán végzett sómentesítéssel kapjuk. A tripszint újra fel lehet használni. A készítmény tisztasága 0,15 imikrogramm/TlU. -Közelítőleg ugyanilyen eredményeket kapunk, amikor kutyák és egyéb emlősök hasnyálmirigyét használjuk kiindulási anyagként. Szabadalmi igénypontok: 1. Eljárás peptidszerű új tmpszin-inhibitor kinyerésére, azzal jellemezve, hogy az inhibitort emlős allatok hasnyálmirigyéből előállított inhibit or-tairtalmú oldatból kationcserélővel adszorbeáltatjuk, -majd elkülönítjük a kationeserélctől, és adott esetben tovább tisztítjuk. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a kationcserélő kainboximetilce'lluló'Z, szulfoetil-oellulóz. fosziforilezett cellulóz vagy kationcserélő gyanta. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás foganatosrítási módja, azzal jellemezve, hogy az inhibitor-tartalmú oldatot emlős állatok hasnyálmirigyének magas hőmérsékleten proteinmentesítő anyaggal végzett homogenizálása és az így nyert oldat semlegesítése útján állítjuk elő. 4. Az előző igénypontok bármelyike szerinti eljárás foganatosítási módja az inhibitor továfobtisztítására, azzal jellemezve, hogy az inhibitor-tartalmú oldathoz tripszint adunk, majd az így komplexbe vitt inhibitort a komplexből tisztított formáiban nyerjük ki. '&. A 4. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a komplexet tartalmazó oldatból elkülönítjük a kísérő anyagokat, amelyek a tripszinnel nem képeznek komplexet, majd a tisztított inhibitor kinyerése előtt a komplexet savas pH mellett felhasítjuk. 6. A 3. igénypont szerinti eljárás foganatosí-Az egyesített inhibitor-frakciókat m/100 am-Hmóniumacetát puffenral ekvilibrált (pH 6) kar-"boxi-metilcellulóz-oszlopra visszük, és az anionos peptideket ugyanezzel a puferrel ki- eo mossuk, majd elöntjük. A kationos peptideket ezután fokozatos eluálással (200 ml m/100 am-mónium-acetát-puffer 6-os pH-val, és 2,5%-os , NaOl-oldat) nyerjük ki. Az inhibitort tartalmazó kationos frakcióit ^5 10 15 20 25 SO S5 40 45 50 55 60 Az új inhibitor tripszinnel komplexet képez, amelyet az inhibitor finom tisztítására lehet használni. E célból a komplexet savas pH mel- 20 lett felhasítjuk, miután korábban elkülönítettük azokat a kísérő anyagokat, amelyek tripszinnel nem képeznek komplexet. A hasítás után 'kapott elegyből -mindkét komponens jó kitermeléssel nyerhető ki. 25
