154057. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és készítmény izocitrát-dehidrogenáz-aktivitás meghatározására
154057 teszi, hogy nem képzett munkaerők is az izocitrátdéMicbrogenáz-aktivitáis mérését elvégezzék. Az izocitrátdehidiragenáz-aktivitás meghatározásia fontos szerepet játszik többek között a hepatitis és imás súlyos betegségek 'diagnosztika- 5 jában. Számos betegség ambuláns ellenőrző vizsgálata sonán és kisebb laboratóriumokban is, a fent vázolt vizsgálat az orvosi diagnosztika fontos segédesizíköziévé vállhat. Különösképpen kiemielíjükí azt, hogy a, találmány szerinti vizsga- 10 lattal a mérés pontossága hatszorosára növelhető, ezenkívül a módszer rendkívül megbízható is. Az alábbi kiviteli példák kapcsán mind az iaoidtráitdemdrogenáz-meghatározását, mind a 15 meghatározásira alkalmas készítmény összetételét és felhasználását részletesen ismertetjük. 1. példa Az alábbi összetételű készítmény az. izocitrát- 20 dehildrogenáz-aktivitás meghatározására alkalmas': 1. oldat: 0,1 imólos 7,4 pH-é!nté)kű trietanolaminos puf- 25 fer 4 3,05 mg% diMórfenolándofenol p, a. 9 x! 10~4 nikotiniamid-aidenindanukletotidfoszfát 2 x 10~2 mólos magnéziumklorid 2,8 x 10-3 'mólos trmatriumizDcitrat S0 2. oldat: 0,1 mólos, 7,4 ptH-értékű trietanolaminos puffer 2,15 img% diikiórfenoilindofenol p. a. 25 9 x 10~4 NADP 21 x 10-2 inólos magnéziumkloirid 3. oldat: 0,1%-os fenazinmetoszulfát. 40 Az oldatok külön-külön, sötét helyen, 0—5 C° között több napon keresztül eltarthatok. 2. példa 45 Szokásos hordozóanyagot, mint piL papírt vagy rostanyagot az 1. péMa szierinti oldatokkal átitatunk és leofilizáló módszerrel szárítunk. Az egyik indikátorcsík az 1. és 3. oldatot tartalmazza, míg az összehasonlító indikátorcsík a 2. 50 és 3. oldattal van kezelve. A vizsgálandó anyagot egyidejűleg az A és B próbacsőbe tesszük és az oldatokat fotometriás után vagy vizuálisan összehasonlítjuk. Abból a célból, hogy a redükálóanyagok nam enzimetikus jellegű befolyását a mérési eredményből kiszűrjük:, a vizsgálatokat vakpróbával hasonlítjuk Az enzim-atotivitás mértékét úgy határozzuk meg, hogy a vizsgálandó anyag beadagolása és a két próbaeső, ill. indikátorcsíkok színegyenlősége között eltelt időkülönbséget mérjük. A vákpróba és a valódi mérés közötti színkülönbség megfelelő megválasztása útján egy meghatározott tartományban iá találmány szerinti izocitrátd'ehidrogenáznaiktivitás kimutatásához használt módszer pontossága aranyira megnövelhető, hogy hatszor olyan érzékeny lesz, mint az eddig ismert módszerek. Szabadalmi igénypontok: 1. Eljárás az állati és emberi szervezet extra-és interceüluláris folyadékában levő izocitrátdehidrogemáz aktivitás látható fény hullámhosszában történő meghatározására, azzal jellemezve, hogy az izotitráitruak «-ketogliutaráttá történő ismert oxidációját nikotinamid-adenindinukleotid fcoenzim segítségével fenazinmetoszulfát, diklórindofenol és magnéziumsók jelenlétében végezzük és az izocitrát ddhidnogeniáz aktivitás mértékét a diklórfeniiindofenol leukoszínezékanyaggá való átalakulásával mérjük. 2. Készítmény az izocitrátdehidrogenáz aktivitás látható fény hulámihosszában történő meghatározására, azzal jellemezve, hogy a készítmény vegyszerkoimponenseit oldaltformában a következő konaentrációtartományoikban tartalmazza: 1. oldat: 1—0,001 mólos trietanolaminos puffer 10~2—10-5 mólos nikotinamid-adenindinuk-leoitidfoszfát diklorfenolindotfenol 10-1 —10~ 4 mólos magnéziumklorid 10_1 —10 -5 mólos trinátriumizocitrát 3. példa A vizsgálat elvégzéséhez az 1. példa szerinti oldatokat az alábbi táblázatból kivehető arányban összekeverjük. Az izocitrát dehidrogenáz-aktivitás meghatározásához használlbató elegy: Próbacső A B 1. oldat 1,80 ml . 2. oldat — 1,80 ml 3. oldat 0,04 ml 0,04 ml 55 60 65 2. oldat: 1—0,001 mólos trietanolaminos puffer 10-2 —10~ 5 mólos nikotinamid-adenindinuk-leotidfoszfát diklórfenolindofenol 10-1 —10 -4 mólos magnéziumklorid 3. oldat: 0,001—1% fenazinmetoszulfát 3. A 2. igénypont szerinti készítmény kiviteli 2
