154035. lajstromszámú szabadalom • Eljárás ergotoxin típusú alkaloidokat termelő, stabil termelőképességű anyarozstörzsek előállítására
3 154035 4 gonya-agár táptalajon alig észlelhető, mert az ilyen táptalajon a gomba megtalálja mindazt, ami a fejlődéséhez szükséges és zavartalanul nő. Ellenben, ha a gombát kevésbé kedvező táptalajra visszük, mint pl. a hüvelyesek magvaiból készült táptalajra, úgy a konidiumok fejlődésében és nagyságuk kialakulásában nagyobb különbségek jelentkeznek. Ezáltal lehetővé válik, hogy speciális szűrőpapírral való szűréssel mintegy 30%-ban apró (2—3 mikron hosszúságú és 1,5—2 mikron átmérőjű) konidiumokat tartalmazó spóraszuszpenziót állítsunk elő. Ha ezt az apró konidiumokat tartalmazó szuszpenziót használjuk fel szélesztésre, speciális, többértékű alkoholon és ásványi sókon kívül nitrogénforrásként csak egy aminosavat, mégpedig aszparagint tartalmazó táptalajon, akkor a telepek nemcsak a fejlődésben mutatnak különbségeket, hanem az egyes telepek színe is eltérő, az okkersárgától a narancsvörösig, vagy a rózsaszíntől a liláig, illetve kékesfeketéig terjedő színárnyalatokban. Az ilyen táptalajokon fellépő színgazdagságnak az az oka, hogy a gomba a nem adekvált viszonyokhoz való alkalmazkodáskor különbözőképpen reagál és különböző módosulatokat hoz létre, még az egy spóráiból kiinduló tiszta tenyészet telepén belül is. Az ilyen módosulatok a szelektálás során egyrészt ismertetőjelként szerepelnek és megkönnyítik a változat mindenkori felismerését, másrészt a változatok kiszelektálása esetén csökken a tenyészet hajlama más formák elszaporodására; a módosulatok könnyen felismerhető volta azonnal lehetővé teszi a fellépő új formák felismerését és elkülönítését. E módszer nagy gyakorlati értékét az .a további felismerésünk biztosítja, mely szerint a fenti táptalajon szélesztett telepek esetében a telep lilás színe mindenkor együtt jár a gomba ergotoxin-típusú alkaloidok jó hozammal történő stabil termelésére való hajlamával és az ergotamin-típusú alkaloidok kiesésével. A lilaszínű telepek kiszelektálása és ennek az eljárásnak a többszöri megismétlése útján tehát ergotoxin-típusú alkaloidokat stabilan, jó hozammal termelő törzsekhez juthatunk. A találmány tárgya tehát oly eljárás az ergotoxin-típusú alkaloidokat parazita módon (rozsnövényen) stabilan termelő anyarozstörzsek előállítására, amelynek során a kiinduló anyagul szolgáló tetszőleges eredetű, szelektálatlan anyarozsot hüvelyes növények magvaiból, célszerűen (Pisum sativum) készült és szacharózt, valamint ásványi sókat is tartalmazó táptalajon tenyésztünk, majd a kapott micéliumból spóraszuszpenziót készítünk, ebben a kisebb méretű {2—3 mikron hosszúságú és 1,5—2 mikron átmérőjű) spórák mennyiségi arányát szűréssel megnöveljük, e spóraszuszpenzióval szélesztést végzünk oly táptalajra, amely szénforrásként valamely 4—6 értékű alkoholt, előnyösen mannitot, nitrogénforrásként pedig aszparagint tartalmaz, majd a keletkezett telepek közül a lilás színűeket kiválasztjuk és tovább tenyésztjük. Ezt az eljárást azután addig ismételjük, míg a lila szín a szélesztéssel kapott minden kolónián azonosan meg nem jelenik. 5 A találmány szerinti eljárás lehetővé teszi a parazita alkaloidtermelésre szánt anyarozstörzsek laboratóriumi módszerrel történő, egyértelműen megbízható eredményű szelektálását azáltal, hogy a telepek szaprofita tenyé-10 szetben mutatott morfológiai, illetve színbeli elváltozásai alapján — amelyek általában az alkaloidtermelés mennyiségi, vagy minőségi változásával járnak együtt — módot nyújt a kívánt termelőképességű telepek gyors felisme-15 résére, anélkül, hogy mindenkor alkaloidmeghatározást kelljen végezni. Példa: 20 Kiindulási anyagul anyarozs szerepel, melynek összalkaloidtartalma 0,35%, amely az ergotoxin-csoporton kívül mintegy 30%-ban ergotamint is tartalmaz. Az ergotamin-tartalom nagymértékben zavarja az ergotoxin gazdasá-25 gos előállítását, miért is szükséges az ergotamint az ergotoxint tartalmazó frakciótól költséges technológiával előzetesen eltávolítani. Ebből az anyarozsból a korábban szokásos félszem-analízissel kiválasztott szklerociumból 30 leojtásokat végeztünk a következő táptalajra: háztartási kristálycukor 4% sárgaborsóliszt 1% ammónium-szukcinát 1% KH2 P0 4 0,1% ca<asro3 ) 2 0,1% MgS04 —7H 2 0 0,03% KCl 0,01% agár-agár 2% csapvíz pH 5,6-ra beállítva. A leojtásokhoz ferde-agár kémcsöveket használtunk. A 4 hetes kémcsőtenyészeteknél az 45 pjtási forgács fölött a micélium posztószerűen átnőtt, kis mélyedést mutatott a kémcsőtenyészet többi részén vékony, sima, kissé nyálas felületű micélium képződött. Mind a micélium, mind a táptalaj világos okker színt mutatott. 50 A 90 db szklerociumból készült leojtás csak az ojtóforgács fölötti posztószerű micéliumszövedéknél észlelhető besüppedésben mutatott kisebb eltéréseket. Minthogy itt különbségek nem mutatkoztak, 5 tetszés szerinti kémcsövet 55 kiválasztottunk, azokból a micéliumot steril spatulával kiemeltük és minden kémcsőnek a tartalmát külön-külön 100-as bronzszitán átpaszíroztuk steril körülmények között. Az így nyert spóraszuszpenzióban apró (2—3 mikron 60 hosszúságú és 1,5—2 mikron átmérőjű) spórákból százalékosan 2—3% volt jelen. Hogy az apró spórákat feldúsítsuk, az átpaszírozott spóraszuszpenziót steril vízzel átmossuk, előzetesen megnedvesített és sterilizált DELTA 65 fekete kereszt jelzésű szűrőpapírra. Az átcsö-2
