153897. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 6-aminopenicillánsavnak biológiai közegből kicsapásos módszerrel való kinyerésére

j53897 3 A közvetlen kiesapásos eljárás előnye az egyszerűsége lenne, de biológiai eredetű oldatoknál nem volt használható a rendkívül magas anyalúg-veszteség miatt. Ennek oka a nagymennyiségű szennyezés szolubilizáló hatá- 5 sában keresendő. Ismeretes az a körülmény, hogy míg a tiszta 6-aminopenicillánsav oldata izoelektromos pontján mintegy 6—8000 gamma/ml koncentrációjú, addig biológiai'eredetű, szennyezett oldatok esetében ez az érték io 12—14 000 gamma/ml-re is megnövekszik. Ezt a nagy anyalúg-veszteséget egyes szerzők a primer oldatnak vákuumban való bekoncentrálásával próbálták ellensúlyozni, de a bepáiiás közben keletkező bomlástermékek szolubilizáló 15 hatása miatt az anyalúg-veszteség is tovább nőtt. E hibák egy részét kiküszöbölt az exírakciós eljárás azáltal, hogy az előzőekben felsorolt szennyezések legnagyobb részétől megszaba- 20 dítja a 6-aminopenicillánsavaí. Bár e módszer nagyüzemileg is használható, sok hátránya van: A) Kielégítő megoszlási hányadost csak nagy feleslegben adott vivőanyaggal lehet elérni. B) Nagy mennyiségű oldószer szükséges a 25 kellő extrakciós hatásfok eléréséhez. C) Az oldószerből kicsapott 6-aniinopenieillánsav finomszemcsés, gyakran kolloidális; a vele való műveletek nehézkesék és/vagy hoszszadalmasak. ;;

0 D) Szeparátorok és egyéb gépek használatát teszi szükségessé, azonkívül nagy anyag- és munkaidőszükséglete van, emiatt a termék önköltsége nem kedvező. E) Nem ad közvetlenül olyan minőségű ter- ;

,5 méket, mely további felhasználásra alkalmas, ezért a nyers-terméket átcsapással kell tisztítani (veszteségek árán). Mindezekéi mérlegelvén célul tűztük ki olyan. izolálási eljárás kidolgozását, mely kiküszöböli az eddig ismert eljárások fogyatékosságait. Bejelentésünk tárgyát képező eljárás megfelel ennek a követelménynek, amennyiben jobb kihozatal mellett, egyszerűbben, kevesebb anyagos munkaíelhasználássai közvetlenül továbbiéidolgozásra alkalmas — megközelítően irodalmi tisztaságú —- terméket eredményez. Eljárásunk alapját képezte azon felismerés, hogy az ammóniumszulfát - közismert fehérjekicsapó hatásán túlmenően -— a savanyítással fehérjementesített biológiai elegyből eltávolítja a bevezetőben felsorolt szennyezések zömét és a 6-aminopenicillánsavnak izoelektromos pontján való oldhatóságát közel egy nagyságrenddel csökkentvén, lehetővé teszi a 6--aminopenicillánsavnak közvetlenül a biológiai miliőből való kinyerését egyszerű kiesapással. Az ammóniumszulfát jelenlétének a fi-aminopenicillánsav oldhatóságára gyakorolt hatását mutatja be az 1. sz. táblázat: 100 ml old áthoz Anyalúg Termék Tisztadott ammóniumtitere súlya sága szulfát (g) gamm/ml (g) %-ban 0 8849 1,1 99,30 40 2455 2,0 99,43 55 1086 2,25 98,23 70 742 2.30 95.00 A 2. sz. táblázat a szűrési idő lerövidüléséi mutatja be (azonos szűrőberendezés és 200—200 ml biológiai elegy esetén), melyet a baktériumilletve enzímfehérjék savas kicsapása, illetve emellett az egyéb szennyezéseknek ammóniumszuifátos kisózása eredményez; kontrollként a hagyományos neutrális szűrést végezve. Használt sav-Szűrési idő Megjegyzés O (Kontroll) Sósav Oxálsav S ósav-f-k i sózás Végtelen 55 perc 30 perc-10 perc 100 ml zavaros szűr let után a szűrés gyakorlatilag megállt. 10 ml szürlet zavaros, többi tiszta. 10 ml szürlet zavaros, többi tiszta. Az egész szürlet tiszta. Eljárásunk tehát lehetővé teszi a 6-aminopenicillánsavnak biológiai úton nyert oldataiból való kinyerését oly módon, hogy e közegben jelen levő szennyezések oldhatóságát erős szerves, vagy szervetlen savval történő pH-állítással és egy szervetlen sóval — előnyösen amrnőniumszulfáttal — történő kisózással lerontjuk, az így kivált csapadékot a sejttömegnek amúgyis szükséges szűrésével egy munkafolyamatban eltávolítjuk; a szennyezésektők így megszabadított oldatból a 6-aminopenicillánsavat egyedül izoelektromos pontjára való állítással kiesapjuk, s abból így nagy tisztaságban és jó kitermeléssel kinyerjük. Az eljárás természetesen nemcsak biológiai folyadékokra, hanem bármery vizes 6-aminopenicillánsav oldatra alkalmazható (az adott feladatnak megfelelő változatában, és 1 :! boinlásarányí 50 nem haladó szennyezés mellett). 696 1 enzimatikus bontásból származó (75/a jelű, elméletileg 11,991 kg 6-aminopenicillánsavat tartalmazó) biológiai elegyet lehűtöttünk +3 C°-ra. Sósavval pH = 2,2-re savanyítottuk, majd 420 kg ammóniumszulfátot adtunk hozzá keverés közben (a megváltozó pH korrigálása mellett). Az elegyből a baciilustömeget kiszűrtük keretes szűrőprésen és ammóniumszulfát tartalmú vízzel utánamostuk. A szürlet pH-ját 20%-os nátriumhidroxiddal 4.26-ra állítottuk, majd a kiváió kristályokat 4 órai állás után. kiszűrtük, mostuk, háromszor vízzel és 60 65 2