153740. lajstromszámú szabadalom • Eljárás B12 vitamin előállítására
153740 6 hát vízben oldódó vagy csak részben oldódó kalciumsókat adunk. Ilyen kalciumsóként pl. kalciumszulfát alkalmazható; különösen előnyösnek bizonyult azonban a szuperfoszfát e célra való alkalmazása, minthogy ez a kalcium-ionok mellett foszfát-ionokat is juttat a tápközegbe, ami tapasztalataink szerint a B12 vitaminszerű faktorok termelésének megnövekedését idézi elő. Azt tapasztaltuk azonban, hogy szuperfoszfátadalék alkalmazása esetén a mikroorganizmusok élesztőkivonatigénye is megnövekszik, így ilyen esetekben a kalcium-és foszfáttartalmú adalék hatása csak akkor érvényesül teljes mértékben, ha a tápközeg elegendő mennyiségű élesztőkivonatot tartalmaz. A kalciumvegyület-adalék B12 -hozamnövelő hatását alábbi kísérleti adataink szemléltetik: a) Az iszapnélküli fermentációnak az 1. példában megadott összetételű tápközegéhez a tápközeg térfogatának 20%-át kitevő mennyiségű, kalciumhidroxidoldatból és 10%-os kénsavból frissen készített, 0,13 g/liter CaS04 -tartalmú vizes oldatot adunk. A fermentáció 4. napján az alábbi B12 -tartalmat találtuk a fermentációs lében (gramm/liter): Kísérlet CaS04 -tart. CaS04 sorszáma tápközeg nélkül 1. 7000 4900 2. 8600 7800 3. 6800 6400 4. 8200 6480 b) Hasonló körülmények között, de a frissen készített CaS04 oldat helyett kereskedelmi minőségű gipsz különböző (0,1%—0,5%) mennyiségét adtuk a tápközegbe. A kalcium-adalék nélkül folytatott fermentációhoz viszonyítva, gipsz-adalékkal az alábbi B12 -hozamnövekedést értük el a fermentáció 4. napján: 10 15 20 25 30 35 40 Kísérlet Gipsz B12 -hozam sorszáma mennyisége megnövekedése 45 1. 0,1% 19% 2. 0,2% 22% 3. 0,3% 45"/o 4. 0,5% 25% 50 c) Ugyancsak hasonló kísérleti körülmények között szuperfoszfátot adtunk kalciumvegyületként a tápközeghez 0,1% mennyiségben, ugyanakkor azonban ötszörösére növeltük a tápközeg élesztőkivonat-tartalmát is. Kísérleti fermentorban végzett 30—30 párhuzamos fermentáció során a fermentáció 5. napján megvizsgálva a fermentációs leveket, a szuperfoszfát-adalékkal végzett fermentációkban átlagosan 29%-kal nagyobb B12 -hozamot kaptunk, mint a szuperfoszfátadalék nélküliekben. Azt találtuk továbbá, hogy a szennyvíz-iszap-inokulumnélküli sorozatos fermentációhoz adaptált baktérium populáció a B12 vitamin és 55 55 60 a B12 vitaminszerű faktorok hozamának növelése céljából prekurzorként általában alkalmazott 5,6-dimetilbenzimidazol helyett részben a jóval olcsóbb o-xilidint is képes prekurzorként hasznosítani. Ha tehát az ilyen adaptált mikroorganizmus-populációval a jelen találmány szerint folytatott fermentáció során a szokásos (pl. 3 mg/liter) mennyiségű 5,6-dimetiibenzimidazol mennyiségét kb. Vi-ére csökkentjük és az elmaradt % részt ugyanilyen mennyiségű o-xilidinnel helyettesítjük, a B12 vitamin és B12 vitaminszerű faktorok hozama nem csökken és ezek egymás közötti aránya sem változik. A találmány szerinti eljárás előnyös kiviteli módja esetében tehát a fermentációs tápközeghez kalcium-ionokat szolgáltató adalékot, pl. kalciumszulfátot vagy még előnyösebben szuperfoszfátot adunk, célszerűen 0,5—1,0 g/liter mennyiségben és/vagy a prekurzorként alkalmazásra kerülő 5,6-dimetilbenzimidazolt kb. % részben o-xilidinnel helyettesítjük. A találmány szerinti eljárásnak az eddig ismert, szennyvíziszap-inokulumot alkalmazó eljárással szembeni előnyei az alábbiakban foglalhatók össze: 1. A fermentáció üzemi lefolytatása sokkal biztonságosabbá válik, mert a szennyvíziszapból származó „vad", a B12 -hozam szempontjából felesleges vagy káros mikroorganizmus-törzsek, valamint a szennyvíziszapban esetleg jelenlevő — ipari szennyekből származó •— toxikus anyagok a fermentáció tápközegéből kiküszöbölődnek és az adaptáció során egy stabilis, jó termelőképességű mikroorganizmus-populáció alakul ki. 2. Megjavul a fermentlé minősége, a szennyvíziszap okozta minőségingadozások megszűnnek és a fermentlé feldolgozhatósága megjavul egyenletessé válik, ami különösen a félfolyamatos ill. folyamatos üzemmenet esetében jelent nagy előnyt. 3. Rövid, 4—5 napos fermentációs idő alatt már igen nagy, 6000—7000 gamma liter B12 vitamintartalmú fermentlé nyerhető és a fermentáció átlagos B12 vitaminhozama kb. 20—25%-kal nagyobb, mint a hasonló körülmények között, de szennyvíziszap-inokulummal folytatott fermentációé. 4. Igen nagy, 15 000—20 000 gamma/liter mennyiségű LLD-aktív anyagot (állattakarmányozásra alkalmas B12 -hatású faktorokat) tartalmazó fermentlé állítható elő rövid idő alatt. 5. A B12 -termelő fermentáció szakaszos, vagy félfolyamatos üzemben egyaránt jól lefolytatható a fenti magas B12 -hozamokkal. A találmány szerinti eljárás gyakorlati kiviteli módjait közelebbről az alábbi példák szemléltetik. 1. példa: Szakaszos fermentáció Egy 10 literes kísérleti fermentorba bemérünk 2000 ml már öt generáción keresztül 3
