153664. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új ACTH-hatású peptidek előállítására
15 153664 16 f) D-Ala-Tyr-Ser-:Met~Glu-His-Phe-Arg-T;ry-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Vál-Tyr-Pro-O'H, 6,CH3!COOH (D-A]a1-béta 1 ~ 24 -kortok'otropin) A tiszta védett tetrakozapeptid-származékot az 1. példában leírthoz hasonló körülmények között 90%-os trifluorecetsav segítségével alakítjuk át a tiszta tetrakozapeptid^hexaacetáttá. Ez a termék alumíniumoxidon történő vékonyrétegű kromatografalás során az alábbi R/-értéket mutatja: R/ 101 = 0,6. A tetrakozapeptid a Saffran-próba során nagy ACTH-aktivitást mutat. 3. példa: a) Z-Arg-Pro-OtBu 5,35 g Z-^Arg-OH és, 5 g pirolin-terabutilész^ ter-hidroklorid elegyét szobahőfokon 70 ml absz. kloroformban szuszpendáljuk. A szuszpenzióhoz 5,1 g ditiklohexü-karbodiimidet adunk, majd az elegyet 50° hőmérsékletre melegítjük, amikoris a kiindulóanyagok oldatba mennek és egyidejűleg új kristályos csapadék képződik. 5 órai állás után az elegyet 0° hőmérsékletre hűtjük, a kristályos terméket leszivatjuk és kloroformmal mossuk. A diciklohexilkarbamid és a dipeptid elegyét megszáradás után 100 ml forrásban levő vízzel extraháljuk, a nem oldódó karbamidszármazékot kiszűrjük és a leszivatással kapott szüredéket .vákuumban szárazra pároljuk be. A maradékból 30 ml izopropanolból történő kristályosítás . után 7,2 g. • védett dipeptidészterhidrokloridot kapunk, amely 178—l'80°-on olvad. Ez a termék szilikagélen történő vékonyrétegű kromatografalás során a ,102 rendszerben 0,62 R/értéket mutat; indikátor: Sakaguchi-reagens. b) Z-Arg-Arg-Pro-OtBu 7,1 g Z-Arg-Pro-OfcBu 70 ml metanol és 6,8 ml 2,1'8 n sósavoldat elegyével készített oldatához 700 mg 10%-os palládiumos aktívszenet adunk és 90 percig hidrogénezzük. Azután a ^katalizátort kiszűrjük és a szüredéket vákuumban szárazra pároljuk be. A maradékot 5,4 g Z-Arg-OH hozzáadásával 17 ml dimetilformamidban oldjuk, az oldathoz 17 ml kloroformot adunk és 0° hőmérsékletre hűtjük le. Keverés közben 4,5 ,g diciklohexil-karbodiimidet, majd 52 ml kloroformot adunk hozzá. Az elegyet éjjelen át 0° hőmérsékleten keverjük, majd vákuumban szárazra pároljuk be. A maradékot 100' ml vízzel eldörzsöljük, a nem oldódó karbamidszármazékot leszivatjuk, vízzel és kloroformmal utána mosva. A vizes fázist elkülönítjük, kloroformmal még háromszor mossuk, majd vákuumban bepároljuk. A tömény oldatot 300 ml Amberlite IRA-400 (acetát-alak) ioncserélő gyantán átszűrjük, majd a peptidszármazék diacetátját vízzel eluáljuk. A frakciónként felfogott eluátumot vékonyrétegű kromatográfiával, 102 rendszerben vizsgáljuk. A 0,35 R/-értéket mutató tiszta frakciókat egyesítjük és vákuumban szárazra pároljuk be. Ilymódon 5 10,2 g tiszta terméket kapunk, ami 97%-os termelési hányadnak felel meg. c) H^Arg-Arg-Pro-OtBu 10 4,5 g Z-Arg-Arg-Pro-OtBu-diacetátot 25 ml metanolban, 500 mg 10%-os palládiumos aktívszén jelenlétében hidrogénezünk, majd a katalizátort kiszűrjük, a szüredéket szárazra pároljuk be, a maradékot pedig 1 ml tri etilamin 15 hozzáadásával 28 ml dimetilformamidban oldjuk. Az oldatot 0° ihőmérsékleten tároljuk és közvetlenül használjuk fel a nonapeptidszármazék szintéziséhez. 20 d) Z-Lys(BOC)-Pro-!Val-Gly-Lys(BOC)-Lysi(BOC) -Arg-Arg-Pro-Ot Bu 4,4 g Z-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-.Lys!(BOC)-Lys(BOC)-hidr;azidot, amelyet pl. a 84475 sz. 25 francia pótszabadalmunkban leírt módon állíthatunk elő, 44 ml absz. dimetilformamidban oldunk, az oldathoz —20° hőmérsékleten előbb 10,8 ml n-sósavoldatot, majd 4,4 ml n-nátriumnitritoldatot csepegtetünk. Az elegyet ez£0 után még 20 percig keverjük —10° hőmérsékleten. Ezután hozzáadjuk a H-Arg-Arg-Pro-OtBu fenti módon elkészített oldatát és az elegyet éjjelen át 0° hőmérsékleten állni hagyjuk. , 35 A reakcióelegyet nagyvákuumban desztilláljuk a dimetilfor mamid eltávolítása céljából, majd a maradékot éterrel porrá dörzsöljük. Ezt a poralakú terméket meleg, etilacetáttal telített, 1%-os ecetsavban oldjuk: és acetát-40 -.alakú Amberlite IRA-400. ioncserélő-gyantát adunk hozzá mindaddig, míg klórionok már nem mutathatók ki. Az ioncserélőt azután leszivatással eltávolítjuk, a szüredéket 100—100 ml etilaeetáttal kétszer extraháljuk, majd az 45 egyesített etilacetátos kivonatot 1%-os ecetsavval extraháljuk kétszer. Az egyesített vizes fázisokat vákuumban szárazra pároljuk be, a maradékot kloroform és metanol 7:3 arányú elegyében oldjuk és 200 g kovasavgélen kroma-50 tografáljuk. 600 ml 7:3 arányú kloroform-metanol eleggyel, majd 400 ml metanollal eluálunk. Ennek során 4,56 g védett nonapeptidszármazékot kapunk diacetát alakjában. A termék vékonyrétegű kromatografalás során egységes 55 anyagnak mutatkozik; a 102 rendszerben kapott R/-érték 0,35. e) H-Lys(BOC)-Pro.-Val-Gly-Lys(BOC)Lys!(BOe)-Arg-A.rg-Pro-OtBu , 60 1. Acetát: 600. mg fenti nonapeptidszármazékot 12 ml metanolban oldunk és 60 mg 10%-os palládiu(55 mos aktívszén jelenlétében hidrogénezzük. A 8
