153082. lajstromszámú szabadalom • Eljárás likopin előállítására
3 153082 4 C C C : N gyűrűt tartalmazzák, mint az imidazol, a piridin és ezeknek behelyettesített származékai. Ezekből a nitrogéntartalmú anyagokból literenként 0,01 és 4 g közötti mennyiséget^ kell a tápközeghez adni a fermentálás megindulásakor vagy közben, egyszerre vagy több részletben. A hozzáadást előnyös a tenyésztés kezdetén foganatosítani. Bármennyi is legyen- a hozzáadott mennyiség és bármikor is végezzük a hozzáadást, a tenyésztést a beoltás után 6—10 napig kell folytatni, hogy a legtöbb likopint nyerjük. A tény észközeg változtat, de lényeges alkotórészei egy-egy asszimilálható szén-^és nitrogénforrás, szervetlen sók, továbbá adott esetben növekedési faktorok, antioxidánsok, felületaktív anyagok és sűrítőszerek. Asszimilálható szénforrásként felhasználhatók szénhidrátok, mint például glukóz, dextrinek, keményítő vagy állati vagy növényi olajok, mint például szalonnaolaj, szójaolaj vagy gya^potmágolaj. Az alkalmas asszimilálható nitrogénforrások igen változatosak: lehetnek vegyi anyagok vagy bonyolult összetételű anyagok, amelyek a nitrogént főképp fehérje alakjában tartalmazzák, mint például a kazein, a laktalbumin, a gluten és hidrolizátumaik, szójaliszt, földimogyoróliszt, élesztőkivonat, szeszmoslék, kukoricalekvár. A hozzáadott szervetlen sók közül egyeseknek tompító vagy közömbösítő hatása lehet, mint ipéldáol az alkálifém- és alkáliföldfémfoszfátoknak, A növekedési faktorok közül leginkább a Bjvitamint vagy tiamint használjuk. Az antioxidánsok közül megemlíthetjük az N,N'-difenil-parafeniléndiamint, a 2,2,4-trimetil-6-etoxi-l,2--dihidro-kinolint, az aszkorbinsavat és a szorbitísavat. A felületaktív anyagok előnyösen nemionosak, mint például a szorbitol zsírsavszármazékai vagy az etilénoxid kondenzátumain alapuló termékek, A sűrítők közül legáltalánosabban alkalmazhatók a keményítő, a karboxiraetiléncellulóz és az agar-agar. Az így készült tápközeget azután beoltjuk Blakeslaa trispora + és — alakjainak tenyészetével (NRRL 2456 és 2457). Az alábbi példák szemléltetik a találmánynak a gyakorlatban való megvalósítását anélkül, hogy azt bármiképpen korlátoznák. i 1. példa: Elkészítjük az A tápközeget a következőképpen: 60 g szeszmoslékot tartalmazó 500 ml vizet 15 percig forralunk. Lehűlése után a következőket adjuk hozzá: Keményítő \ 60 g Szójaolaj 35 ml 6 Gyapotmagolaj 35 ml Keményítőkivonat lg Káliumdihidrogénfoszfát 0,5 g 10 Mangánszulfát-monöhidrát 0,1 g Tiaman-hidroklorid 0,01 g , Az oldat térfogatát desztillált vízzel 1000 mire egészítjük ki, majd beállítjuk néhány csepp 10 n nátronlúggal 6,3 pH-ra, elosztjuk 300 ml-es Erlenmeyer-lombikokban 50 ml-es adagokra, 20 majd 20 percig 120 C°-on sterilizáljuk. Sterilizálás és lehűlés után minden' lombikba 0,5 ml steril 5%-os petróleumos 2,2,4~trimetil-6-etoxi-1,2-dihidro-kinolin oldatot adunk. A B, C, D tápközegek hasonlóan készülnek, 25 mint az A közeg, de minden lombikhoz sterili. zálása után petróleumon és antioxidánson kívül az alább megadott mennyiségű imidazolt adjuk híg sósavval közömbösített és sterilen szűrt vizes oldat alakjában: B tápközeg: 0,1 ml 2,5%-os steril vizes imidazol oldat; C tápközeg: 0,25 ml 20%-os steril vizes imi-35 dazol oldat; D tápközeg: 1 ml 20%-os steril vizes imidazol oldat. 40 Ezután minden A, B, C és D tápközeget tartalmazó lombikot beoltunk a Blakeslea trispora törzs + és — alakja (NRRL 2456 és NRRL 2457) 48 órás felrázott tenyészetéből 5—5 ml-rel. Ezután a lombikokat 26 C°-os szekrényben lévő, percenként 220 fordulatú keverőállványra helyezzük. Két napi inkubáció után minden lombikhoz 0,5 ml petróleumot adunk. Ezután a tenyészeteket ugyanolyan hőmérsékleten keverés köz-50 ben további 8 napig kezeljük. Ennek az időszaknak a végén valamennyi lombikban a bétakarotin vagy likopin termelés a legnagyobb. A béta-karotin és a likopin mennyiségi meghatározását a következőképpen végezzük: a mi-55 céliumot szűréssel elválasztjuk, vízzel mossuk, msajd éjjelen át vákuumban 35 Cf-on szárítjuk. Ezután a száraz micéliumot hexánnal extraháljuk. Végül a kivonatot alumíniumoxidon kromatografáljuk. A béta-karotint és a likopint éo tartalmazó frakciókat külön gyűjtjük össze. Az így elválasztott béta-karotint és likopint spektrofotometriai úton határozzuk meg, összehasonlítva egy standard oldattal. A fent leírt tenyészetek a következő eredmé<SS nyéket szolgáltattak:
