152683. lajstromszámú szabadalom • Eljárás ergobazin előállítására
3 1&2683 4 Illionis USA intézetnél NRRL 3081 és 3082 sz. alatt letétbe helyeztük. Az eddig leírt Claviceps paspali Stevens et Hall törzsekkel (vö. Arcamone és mtsai, Proc. Roy. Soc. Serials B, 155, 26, 1961; Nature, 187, 238, I960) ellentétben ez az új törzs in vitro konidiuimképzésre képes. A mikrobiológiai eljárások ipari méretekben történő kivitelezése szempontjából ugyanis igen nagy fontossággal bír az a (körülmény, hogy az illető gomba képez-e konidiumokat vagy sem. Konidiumok segítségével ugyanis egyspórás elkülönítésre van lehetőség és ezáltal genetikailag egységes kultúrához juthatunk. Emellett a konidiumokból röntgen- és ibolyántúli besugárzás, valamint vegyszeres kezelés útján sokkal könynyebben lehet mutánsokat előállítani és elkülöníteni, mint a steril micéliumból. A konidiumokkal megfertőzhetünk továbbá virágzó Paspalum-növényeket és ily módon a természetes gazdanövényeken állíthatunk elő szkleróeiumokat, amelyek kiválóan alkalmasak a törzs tartósítására. Az ilyen eltartható anyagból pl. bármikor friss oltóanyagot 'készíthetünk, amikor az in vitro tenyésztett kultúrák ismételt átoltásdk során degenerálódnak. A konidiumokat liofilizált, ill. fagyasztva szárított állapotban korlátlanul tárolhatjuk, ami szintén lehetővé teszi a törzs tartósítását. Végül a tápoldatok beoltására is a konidium-szuszpenziók a legalkalmasabbak, minthogy ilyenekkel tudjuk a beoltandó menynyiséget a legcélszerűbben adagolni és ilyen szuszpenziókkal tudunk a legkönnyebben steril módon dolgozni. A steril micéliumot viszont a munka megkezdésékor előbb egy keverőberendezésben homogenizálni kell. Az új gombatörzs elkülönítése és szaporítása az alábbi módon történik: -' Egy szklerócium belsejéből egy kis szövetdarabot steril körülmények között kiveszünk és söreefre-ágárra visszük át. (összetétel: 250 ml komlózatlan világos söroefre, 17% szárazanyag-tartalommal, 18 g ágár-ágár; desztillált vízzel 1 literre feltöltve; pH = 5,2.) Az agáron egy kerek telep fejlődik ki, amely 14 nap alatt (24 C° hőmérsékleten tartva) 15 mm átmérőjűre növekszik. Ez a telep az agárra felfekvő, kb. 1 mm vastag, pszeudoszkleroeiális szerkezetű bőrből és egy efölött kifejlődött, fehér légmioélium-parnából áll. Az agárba egy barna színezőanyag diffundál be. Konidiumok nem képződnek. Ezt a telepet egy spatulával darabokra osztjuk és e darabokat egy kémcsőbe visszük, amely 12 ml alábbi összetételű ágár-táptalajt tartalmaz: sörcefre 500 ml kukoricalekvár (szárazanyag) 60 g tejsav 1 ml ammőniumklorid-oldat 4,8 pH-ig ágár-ágár 20 g desztillált vízzel feltöltve 1 literre. Az inokulum minden darabja körül egy kis kolónia alakul ki, amely eleinte fehér, később vörösesbarna micéliumból áll. 10 nap múlva a hypha-csúcsokon konidiumok kezdenek lefűződni. 20 nap múlva már elegendő konidium képződött ahhoz, hogy vizes konidiuim-szusz-5 penziót lehessen készíteni. Ezzel a szuszpenzióval 20 ferde ágáros kémcsövet (a fenti összetételű ágáros táptalajjal) oltunk be. A kultúrákat 24 C° hőmérsékleten inkubáltatjuk. A konidiumok 25—36 óra múlva csíráznak ki. 6 nap 1° múlva az agár felülete finom fehér micéliummal van egyenletesen bevonva; 10 nap múlva barnásszürke, finoman ráncos micóliumtakaró képződött, amely szorosan felfekszik az agáron és csupán rövid levegő-hyphák vannak rajta. 15 Ezeken konidiumok fűződnek le. 12 nap múlva a micéliumban több helyen központok alakulnák ki, amelyekben egy vörösesbarna folyadék apró cseppecskéi választódnak ki. Ezek a cseppecskék 1—3 mm átmérőt érnek el és rövidesen 20 tejszerűen zavarosak lesznek a nagyszámú konidium következtében. 16—18 nap múlva a konidiumképződés gyakorlatilag lezárult. Egy 2 cm átmérőjű kémcsőben 12 ml ágár-táptalajt tartalmazó ferde agár kultúrában kb. 109 koni-25 dium termelődik. Az alámerülő kultúra tenyésztésének céljaira először egy előkultúrát készítünk az alábbi módon: Közegként 4,5%-os vizes malátakivonat^olda-30 tot alkalmazunk, amelynek pH^értéke 5,4. 1 liter ilyen oldatot egy 2 literes Erlenmeyer-lombilkban 20 percig sterilizálunk 110 C° hőmérsékleten, majd egy 17 napon ágáros kultúrából vett 4-108 konidiummal beoltjuk, majd forgó 35 rázógépen 3 napig inkubáltatjuk 24 C° hőmérsékleten. Finom micélium-pelyheket tartalmazó sűrű kultúra képződik. Ezek a pelyhek egy laza hypha-csomóból állnak, átmérőjük 2—4 mm. A kultúráiban alkaloidok nem mütatha-40 tófc ki. Nagyobb mennyiségű előikultúra előállítására 10—10 liter fenti összetételű közeget tartalmazó üveg-f erimentorokat egyenként 4-109 konidiummal beoltunk és 23 C° hőmérsékleten 3 napig 45 inkubáltatjuk, percenként 6 liter levegővel szellőztetve és percenként 300 fordulattal keverve. A habzás leküzdésére szilikon-emulziót alkalmazunk. Az így fermentorokban tenyésztett kultúrák ugyanolyan tulajdonságokat mutatnak 50 mint a rázott kultúrák. A termelő kultúra céljaira az alábbi összetételű tápoldat bizonyult különösen alkalmasnak: szorbit 50 g borostyánkősav 38 g KH2 P0 4 2g MgS04 0,3 g FeS04 -7H 2 0 1 mg ZnS04 -7H 2 0 10 mg desztillált vízzel feltöltve 1 literre; pH ammóniával beállítva 5,4. Ezt a tápoldatot egy 3 napos előkultúra 10%ával beoltjuk és 100 ml-es adagokban, 500 ml-es 65 Erlenmeyer-lombifeban, egy reciprok-műkö-2
