152576. lajstromszámú szabadalom • Eljárás tetraciklin gazdaságos előállítására
152576 fermentációjakor keletkező fermentlé feldolgozása úgy történik, hogy a fermentlevet sav adagolásával pH 1—4 értékre állítjuk be, majd a mieéliumot szűrjük. Az új törzs egyik előnye, hogy a fermentlé feldolgozása különösebb prob- 5 lémát nem okoz, a micélium jól szűrhető. A szürletből a tetraciklin a korábbi kevesebb tetraciklint termelő törzseknél ismertetett módszerekkel izolálható; a nagyobb egységszám az izolálást nem nehezíti sőt előnyösen befolyá- 10 solja. Különösen előnyös a tetraciklinnek tetranollal képezett addíciós vegyülete formájában való lecsapása (151.519 sz. magyar szabadalmunk), de alkalmazható a 149.186 sz. magyar szabadalom szerinti szterogenolos kicsapás, vagy 15 más ismert eljárás is. Eljárásunk részletei a példákban találhatók, azonban jelen találmány köre nem korlátozódik e példákra, hanem érvényessége értelemszerűen kiterjed más, a példákban be nem mu- 20 tátott technológiai változatokra, kinyerési folyamatokra, táptalaj-összetételekre, melyeket a Streptomyces aureofaciens A—802.934 törzsnek vagy lényegileg ismert módon előállított utódának fermentációjához használunk. 25 Példák: 1. A Streptomyces aureofaciens A—802.934 törzs szilárd táptalajon kifejlődött spórás te- 30 nyészetébői oltunk 50 ml steril előinokulum táptalajt (500 ml Erlenmeyer-lombikban). A szilárd táptalaj összetétel: kukoricalekvár (nedves) 0,65%, szacharóz 1,0%, KH2 P0 4 0,4%, (NH4 ) 2 S0 4 0,2<y 0 , MgS0 4 0,5%, agar 2,0%, pH: 35 6,6. Az előinokulum táptalaj összetétele: kukoricalekvár (nedves) 2,0%, szacharóz 2,0%, CaC03 0,2%, (NH4 ) 2 S0 4 0,1%, KH 2 P0 4 0,5%, MgS0 4 0,25%, pH: 6,5. A tenyészetet 28 C°-on 24 órán át inkubáljuk rázóasztalon (320 rázatás percen- 40 ként), majd a kifejlődött tenyészetet (50 ml) átoltjuk 12 literes üvegfermentorba, mely 6 liter inokulum táptalajt tartalmaz, és 6 liter/perc átmenő levegő és 440 fordulat/perc keverés mellett 28 C°-on inkubáljuk, 36 órán át. Az inoku- 45 lum táptalaj összetétele: kukoricalekvár (nedves) 1,6%, szacharóz 3,0%, (NH^SO,; 0,7%, CaCOg 0,5%, pH: 6,5. A kifejlődött tenyészet 300 ml-ét átoltjuk 6 liter fermentációs táptalajba (12 literes üvegfermentorban), és az 50 inokuluméval azonos körülmények között 88 óráig fermentálunk. A fermentációs táptalaj összetétele: kukoricalekvár (nedves) 2,5%, keményítő 6,0%, mogyoróliszt 1,5%, (NH4 ) 2 S0 4 0,8%, CaC03 0,9%, MnS0 4 0,014%, pálmaolaj 55 0,5%, pH: 6,5. A táptalaj kloridtartalma 310 y/ml. A fermentáció folyamán meghatározzuk a fermentlé tetraciklin tartalmát 40 óra 64 óra 70 óra 88 óra 60 2500 6300 8550 10.450 E/ml Az így nyert fermentlé 10 literét koncentrált HCl adagolásával pH: 2,2-re állítjuk be, majd szűrjük. A szűrt savas léhez hozzáadunk 1 liter 65 10%-os MgCl2 oldatot, majd 20%-os NaOH oldattal a pH-t 10-re állítjuk. A kicsapódott magnéziumkomplexet szűrjük, vízzel mossuk, és szárítjuk. A 250 g szárított komplexet 125 ml vízben felszuszpendáljuk és kis részletekben 125 g (NH4)2 S0 4 -ot tartalmazó oldatot adagolunk hozzá, keverés közben. Teljes oldódás után a vizes oldatot kétszer (250+150 ml) n-butanollal extraháljuk, 1—1 órán át. A butanolos fázishoz 5 g lignint adunk, majd 50 ml metanolt és 30 percig keverjük, majd szűrjük. Ezután 75 ml 2 n HCl-val, majd 75 ml 0,1N HCl-val visszaextraháljuk a tetraciklint vizes fázisba, és NaOH oldattal a pH-t 5,2-re állítjuk. A kivált bázist szűrjük, mossuk és vákuum alatt szárítjuk. A termék 70 g, 880 E/mg aktivitású. (Kitermelési százalék: 59,2.) 2. A Streptomyces aureofaciens A—116.007 törzs szilárd táptalajon, kifejlődött spórás tenyészetéből oltunk előinokulum, majd inokulum táptalajt, melyek összetétele, s a fermentációs technológia azonos az 1. példában foglaltakkal. A kifejlődött inokulumból beoltunk fermentációs táptalajt, s az 1. példában leírtak szerint fermentálunk 80 óráig, s a fermentlé tetraciklin tartalma 11.250 E/ml. Az előállított fermentlé pH-ját ION kénsavval pH: 2,2-re állítjuk, majd szűrjük. A szürletet NaOH oldattal pH: 5,5-re állítjuk, majd hozzáadunk 50 g CaC03 -ot és 50 g CaCl 2 -ot, ezután a pH-t 8,0-ra állítjuk ammóniumhidroxiddal. A kivált tetratiklin-kalcium-komplexet-kalciumsót szűrjük, majd szárítjuk. A keletkezett 240 g terméket 360 ml vízben felszuszpendáljuk, majd a pH-t 1,8-ra állítjuk, szűrés után 50 g NaCl-t hozzáadunk, háromszor 100—100 ml n-butanolba extraháljuk. Az összesített extraktumokból a tetraciklint visszaextraháljuk 150 ml 2 n HC1-ba, majd 150 ml 0,1 n HCl-ba és NaOH oldattal a pH-t 2,5-re állítjuk, majd etanolaminnar 5,2-re. A kivált tetraciklin bázis szűrés, mosás és szárítás után 990 E/mg aktivitású, és 70,4 g. Kitermelés 62%. 3. Az 1. példa szerint előállított, 10.450 E/ml tetraciklint tartalmazó fermentlevet oxálsawal pH: 2,0-re állítjuk és a mieéliumot kiszűrjük. A szűrt fermentlé pH-értékét tömény NE^OH-dal 3,0-ra állítjuk be, majd 85 g dodecilacetát-piridiniumklorid 10%-os vizes oldatát adagoljuk a rendszerbe, állandó keverés mellett, majd a vég pH-t tömény NH4 OH-dal 7,5-re szabályozzuk. A képződött csapadékot kiszűrjük, és 300 ml n-butanolban vesszük fel, majd 10% oxálsavat tartalmazó 300 ml n-butanolt adunk hozzá. Ekkor az oldat pH-ja kb. 2,0-re áll be, és csapadék válik ki, melyet szűréssel eltávolítunk. A butanolos oldatból a tetraciklint 0,01 n HCl-ba extraháljuk. Az extraktumot 10%-os NaOH oldattal pH: 5,2-re állítjuk be. Ekkor az oldatból kiválik 83 g tetraciklin hidrát, melynek hatóanyagtartalma 890 E/mg, a kitermelés 68,5%. 3
