152435. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a B12-vitamin csoportba tartozó vegyületek előállítására
3 152435 4 ugróan magas szintézisével a 104/b torzs tűnt ki. Ezt a képességet többszörös átoltás után is megtartotta. A 104/b telepet a fent megadott táptalajban szaporítottuk el. Az újszerű mutációval előállított törzs a Bergey-meghatározóban szereplő tulajdonságok öszszehasonlításakor a Propionibacterium shermanii törzsektől és a többi Propionibacteriumtól cukorbontóképességében különbözik. Az utóbbiak ugyanis a fruktózet és a dextrózet bontják, míg a 104/b törzs a dextrózet gyorsan, a fruktózet pedig nem bontja. A 104/b törzs gyorsabban szaporodik, mint a kiindulási törzs. A baktériumok különösen a növekedési időszakban nagyok és elágazóak, morfológiai tekintetben egyébként hasonlóak a kiindulási törzshöz. A törzs előnyös tulajdonságai a fermentáció során elsősorban a lényegesen megnövekedett B12 -vitamin típusú vegyülethozamban nyilvánulnak meg. A törzs hidroxokobalamin mellett kb. 20% cianokobalamint állít elő anélkül, hogy a fermentációhoz cián ionokat kellene adagolni. A hidroxokobalamin kívánt esetben ismert módón cianokobalaminná alakítható, és így végeredményben 25—30 mg/l (kémiai meghatározással) eianokobalamin nyerhető. (Coli-titerrel történő meghatározással az értékek természetesen lényegesen magasabbak.) A találmányunk tárgyát képező törzzsel való fermentálás további előnye, hogy a törzs alkalmazásakor nyert fermentlé 7-től 7,5 pH mellett minden külön kezelés nélkül könnyen szűrhető, ami a feldolgozást lényegesen leegyszerűsíti. A törzs kitűnő vastűrőképességgel rendelkezik. A fermentációhoz 2000 gamma/ml vasszulfátot adagolva a kontrollhoz képest sem a növekedésben, sem a termelésben nem mutatkozott lényeges eltérés. A törzs előnye, hogy viszonylag nagy hőfokintervallumban (20—36 C°) csupán a fermentáció sebessége változik, de termelőképessége változatlan. A 104/b törzs fermentációja az egyébként szokott módszerekkel anaerob körülmények között optimálisan 6,5-től 7 pH értéken végezhető el. A fermentációhoz előnyösen 2—7% kukoricalekvárt és 2—10% glükóznak megfelelő hidrolizátumot (keményítő, keményítőtej, kenyér stb.) tartalmazó táptalajt alkalmazunk. A fermentáció időtartama a táptalaj koncentrációjától függően 40-től 96 óra. A fermentlevet kívánt esetben humán gyógyászati termékké, vagy állattakarmánnyá dolgozhatjuk fel. A baktériumtesteket a fermentléből neutrális pH-értéken való szűréssel nyerjük ki. Eljárásunk előnyös foganatosítási módja szerint a baktériumokat a további feldolgozás céljából forró vízzel extraháljuk, az extraktumot bepároljuk a fermentiere vonatkoztatott század térfogatra, majd ismert módon, pl. extrákéi óval és adszorpcióval tisztítjuk. Erjárasunkkal jó minőségű kristályos Bi2 -vitamin állítható elő. Eljárásunk további részleteit a példákban ismertetjük. 5 Példák: 1. A fermentációt a Propionibacterium shermanii 104/b jelzésű mutánssal folytatjuk le a következő komponenseket tartalmazó tápoldatot 10 használva 4 1 térfogatban: 10% glükóz-tartalmú kenyér-hidrolizátum 800 g/l Kukoricalekvár (sz. a.) 20 g/l Kaldumpantothenát 20 mg/l pH: 6,5 15 A kenyérhidrolizátumot a többi táptalaj-komponenstől elkülönítve sterilizáljuk 120 C°-on 20 40 percig. A fermentációs táptalajt 25% 3—4 napos megfelelő fejlettségű tenyészettel beoltjuk. Az oltóanyagot a következő összetételű táptalajon tenyésztjük: 25 Glükóz 80 g/l Kukoricalekvár (sz. a.) 20 g/l CaC03 4 g/l pH: 7,3 *0 Oltáskor a pH-t ammóniumhidroxiddal 6,8— 7,0-re állítjuk be steril körülmények között. A fermentációt 28 C°-on folytatjuk le. A H+ konoentráció a fermentáció intenzív szakaszában 4 óránként 0,6—0,8 pH egységgel növek-35 szik. A pH korrigálás 6,8—7,0-re 4 óránként ammónium-hidroxiddal történik. A 104/b mutáns szaporodási szakasza 64—72 órás korában befejeződik, eléri a 6,0—8,0 • 1010 /ml baktériumot. A fermentációt 80 óráig folytatjuk, ekkor 4C 1 mg/l mennyiségű 6,5 dimetilbenzimidazolt adagolunk. Papírkromatografiás módszerrel a fermentlé 8 mg/l cianokobalamint tartalmaz, további 20 mg/l Bi2-vitaminszerű anyag mellett. 2. Az 1. példa szerinti körülmények között 45 fermentálva 80 óra után 1 mg/l mennyiségű 5,6 dimetilbenzimidazolt adagolunk, majd 24 óra múlva a fermentációs lé B12 -vitamin-tartalmát KCN-os főzés után (20 perc) E. coli agár-diffúziós módszerrel meghatározzuk. A fermentációs $0 lé aktív B12 -vitaminszerű anyag tartalmát 80 órás korában 86 mg/l-nek találtuk. Kémiai módszerrel ugyancsak káliumcianidos főzés után papírkromatográfiás úton 27 mg/l-nek találtuk a B12 -vitamin-tartalmat. 55 3. A Propionibacterium shermanii 104/b mutáns 3—4 napos megfelelő fejlettségű tenyészetével 40 000 l-es fermentort oltunk, mely az alábbi komponenseket tartalmazó steril táptalajt tartalmazza: 60 Kenyér hidrolizátum (10% glükóz tart.) 450 ml/l Kukoricalekvár (sz. a.) 20 g/l Kalciumpantothenát 20 mg/l 65 pH: 6,5
