152370. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nagytisztaságú hirudin előállítására orvosi piócákból

MAGTAR NÉPKÖZTÁRSASÁG ORSZÁGOS TALÁLMÁNYI HIVATAL SZABADALMI LEÍRÁS Bejelentés napja: 1964. VI. 22. (AE—175) Német Demokratikus Köztársaságbeli elsőbbsége: 1964. I. 27. Közzététel napja: 1965. V. 22. Megjelent: 1966. III. 01. 152370 Szabadalmi osztály: 30 h 1—8 Nemzetközi osztály: A 61 k Decimái osztályozás: Feltalálók: Dr. Dr. Markwardt Fritz professzor, Erfurt, Dr. Schaefer Gerhard mérnök, Radebeul, Töpfer Horst oki. vegyész, Radebeul, Dr. Walsmann Peter, Erfurt, Német Demokratikus Köztársaság Tulajdonos: VEB Arzneimittelwerk, Dresden, Német Demokratikus Köztársaság Eljárás nagylisztaságú hirudin előállítására orvosi piócákból A találmány tárgya eljárás az orvosi piócában található véralvadást gátló anyagnak, a hirudinnak a kinyerésére nagy tisztaságban. Ismeretes, hogy az orvosi pióca egy olyan gátló anyagot tartalmaz, amely a véralvadás lefolyását specifikusan befolyásolja olyan módon, hogy a trombin nevű alvadási enzimmel sztöchiometrikusan jól definiált komplexet képez, aminek következtében a trombin hatása megszűnik. Egy ismert eljárás szerint az extrakcióval víztelenített piócafej ékből aceton és víz elegyeivel, valamint frakcionált acetonos kicsapással olyan nyers terméket kapnak, amelyet elektrodialízissel, propanolos extrakcióval, valamint ezt követő papírelektroforézissel tisztítanak. Javasolták továbbá a hidrudinnak nagy tisztaságú alakban történő kinyerését etanolos frakcionálás, oxi-cellulózzal való kezelés és műgyanta alapú, gyengén savas kationcserélőn való adszorbeáltatás útján. Azt találtuk, hogy a készítmény további tisztítása lehetséges géiszűrési módszer útján, erősen térhálósított dextrán segítségével. Vizes hirudin-oldatok hosszú gél-oszlopokon való átszúrásé révén sikerült további balasztanyagokat elkülönítenünk. A polipeptid hirudint a felfogott frakciókból alkoholos kicsapással vagy liofilizálással könnyen ki lehetett nyerni. A gél-10 15 20 25 30 szűrés alkalmazása révén az előtisztított hirudin-preparátumok fajlagos aktivitása 1,5—2-szeresre növekszik. Ugyanakkor a nagy tisztaságú hirudin hozama 80% és 90 % között mozog. A találmány szerinti eljárás előnyei abban állnak, hogy az elkülönítés tisztán vizes oldatban megy végbe, és az oszlopátmérő növelése révén tetszés szerinti mennyiségű hirudin-készítmény tisztítható meg. A találmány szerinti eljárás foganatosítására az alábbi kiviteli példát adjuk meg. Példa: 250 mg 4420 ATE/mg (antitrombin-egység/ mg) fajlagos aktivitású hirudint 1 ml vízben oldunk, és az oldatot dextrán-géllel töltött oszlopra visszük fel. Az oszlop legkedvezőbb mérete 130X1 cm. Az oldatnak a gélágyba való behatolása után az oszlopra óvatosan desztillált vizet rétegezünk, és ezután elkezdjük az eluálást. Az eluálás sebessége mintegy 10 ml/óra. Az eluátumot 3 ml-es frakciókban fogjuk fel. Az első 60 ml ballasztanyagokat tartalmaz, és a hirudin-aktivitásnak csak egy nagyon csekély részét. A hirudin fő mennyiségét az ezután lefolyó 20 ml tartalmazza. Ezt követően kis mólsúlyú szennyezések következnek 152370