152361. lajstromszámú szabadalom • Eljárás egy új polipeptid előállítására
152361 6 c) iN^kajjboíbenzoxi-L-glutaminil^L-aszparaginil-S-benzü-L-ciszteinil-L-prolil-N-delta-p-töluolszulfonil-ÍL-orniítil-glicin-amid 100 g N-karbobenzoxinL-prolil^N-delta-p-to-- 5 luolszulfonil-<L-arnitil-glicinamidot 500 ml brómhidrogénsawal telitett vízmentes ecetsavban oldunk, az oldatot 20° hőmérsékleten 1 óra hosszat állni hagyjuk, majd vákuumban,, 40° alatti hőmérsékleten bepároljuk, A maradékot 10 dietiléterrel gondosan mossuk, majd hozzáadjuk 100 g N-:fearbobénzoxi-L-gluteminil-L-aszpanaginilMS-benzil-LjciszteinilHazid és 26 ml trietilamin 1000 ml dimetilformamiddal készített oldataihoz. Az elegyet éjjelen át 20° hőmérsék- 15 léten állni hagyjuk, majd 3000 ml etilaoetátot adurik hozzá, a képződött csapadékot leszűrjük és etilacetáttal mossuk. Ily módon 105 g N--J fearbobenzoxi-i]>glutaminil-L-aszparaginil-S-benzil-!Lr-ciszteiml-'L-J prollil-4N-delta-pjtoluolszul- 20 foniUj-ormtil-glicinamidot: kapunk, amely 193°on olvad; '(<*)D20== —39° (dimetilformamidban). d) NikarbobenzoxiJS-benzil-L-cisztemil-OLi-fenilalianil-L-fenilalanil-L-glutaminil-L- 25 -aszparaginil^S-benzil-L-ciszteinil^L-prolil-N-delta^p-toluolszulfonilHL-ornitil-glicinamid 50 g iN-^karibobenzoxi-L-glutaminil-L-aszparaginil-S-benzil-iL-ciszteinil-L-prolil-iN-delta-p- 30 -toluoIszulfonil-L-ornitil-gncinamidot 250 ml brómhidrogénsawal telitett vízmentes ecetsavban oldunk és az oldatot szobaihőfökon (20°) 1 óra hosszat állni hagyjuk. Azután az oldószert vákuumban, 40° alatti hőmérsékleten el- 35 párologtatjuk, a maradékot dietiléterrel gondosain mossuk, majd 3)1,5 g N-karbobenzoxi-iS-benzil^L-ciszteinil^L-fenilalanil-iL-fenilalanil-azid és 7,5 ml trietilamin 250 ml dimetilformamiddal készített oldatát adjuk hozzá. Az 40 elegyet 20° hőmérsékleten 2 napig állni hagyjuk, majd 1000 ml etilaoetátot adunk hozzá, a képződött csapadékot elkülönítjük és etilacetáttal mossuk. 30° hőmérsékleten vákuumban történő szárítás után a terméket meleg metanol- 45 lal mossuk. Ily módon 45 g N-karbobenzoxi-S-Jbenzil-íL-ciszteinil-L-fenilalamlJL-femlalanil-L-glutaminil-L-iaszparaginil-iS-benzil-L^ciszteiml-iL-prolil-'N-.delta-p-toluolszulfonil-Ij-ortiml-glicinamidot kapunk, amely 224°-on olvad; 50 (a)D21 =—40° i(dimetilf ormamidfoan). e) L-ciszteinil-L-femlalanil-L-fenilalanil-íL--glutaminil-Lr-aszparaginil-L-ciszteinil-L-proIil-L-ornitil-glitinamid 55 az oldat tartósan kékre színeződjék. Ezután az oldathoz még 3 g ammóniumkloridot adunk és az elegyet szárazra pároljuk be. A maradék tartalmazza az , L-ciszteinil-L-fenilalanil-'L-fenil-alanil-iL-glutamin;iWL^aszparaginil-L-ciszteinil-nL-prolil-L-ornitil-glicitnamidot. f) (I) toépletű polipeptid Az e) alatt leírt módon kapott maradékot 5 liter 0,01 n eoetsavoldatban oldjuk és 6,5—8,0 pH-érték mellett, 20° hőmérsékleten levegő vagy oxigén 1 órai bevezetése útján oxidáljuk. Az oldatot azután híg sósavval 4,0—5,0 pH-értékre állítjuk, 50 g nátriumkloridot vagy 0,64 g metánszulfonsavat vagy 0,76 g trifluorecetsavat adunk hozzá, majd szárazra pároljuk be, amikoris jól eltartható száraz port kapunk. Ezt tárolhatjuk és felhasználáskor tiszta oldattá oldhatjuk. Felhasználhatjuk azonban közvetlenül a fenti módon oldatot is, esetleg vízzel vagy sóoldattal felhígított állapotban. A szervetlen sók eltávolítása céljából a fentemlített, trifluorecetsav hozzáadásával kapott port ellenáramú megosztásnak vethetjük alá 120 :160 :1 arányú szek.butanol-víz-trifluorecetsav rendszerben. 200 átviteli fokozat után az anyagot az 57—77. csövekben tápláljuk, maximummal a 67. csőben (K=0,50). Bepárlás után jó hozammal kapjuk a hatásos polipeptidet, higroszkópQs trifluoracetátja alakjában; ez a termék kromatográfiás és elektroforézises vizsgálat esetén egységesnék mutatkozik. Papírelektroforézis esetén a migráció 5,8 pH>érték és 40 V/cm esetén 60 perc alatt 50 mm '(az összehasonlításul használt hisztidin 65 mm-t vándorol). A papír-elektroforézis migráció 1,9 pH-érték: ós 40 V/cm esetén 60 perc alatt 69 mm (az összehasonlításul alkalmazott triptofán 66 mm-t vándorol). A 35 : 35 :30 arányú izoamilalko'hol-piridin-víz rendszerben lefolytatott papírkromatografálás esetén az R/^érték 0,28. A 6 n sósavoldattal 110° hőmérsékleten 16 óra hosszat folytatott teljes hidrolízis ekvimolekuláris mennyiségekben az alábbi aminosavakat szolgáltatja: tisztin, glutaminsav, aszparaginsav, prolin, ornitin és glicin, míg a fenilalanint az ekvimolekuláris mennyiség kétszeresének megfelelő mennyiségben kapjuk. A termék biológiai hatásosság-értékei: patkányon a vérnyomásra, való hatás 150 NE/mg, a diurézist gátló hatás 15 NE/mg, a patkány-uterusra kifejtett hatás pedig már 1 NE/mg-nál kisebb adagban is mutatkozik. 5 g N-kíarbobenzoxi-iS-benzil-L-ciszteinil-L-fenilalanil-L^fenilalanil-L^glutaminil-L^aszparaginil-'S-benzil^L-ciszteinil-L-prolil-N-delta-p- 60 -toluolszulfonil-iL-ornitil-glicinamid 1200 ml vízmentes cseppfolyós ammóniával készített oldatához az oldat forrpontjának megfelelő hőmérsékleten történő keverés közben fém-nátrium vagy fém-kálium oly mennyiségét adjuk, hogy 55 2. példa: Az 1. példában leírthoz hasonló módon járunk el, de azzal az eltéréssel, hogy utolsó lépésként az oxidációt 7,5 ml vizes n-hidrogénperoxid oldattal folytatjuk le '(levegővel, ill. oxigénnel történő oxidálás helyett), 7,5—8,0 pH-értéken, 0—40° hőmérsékleten. 3
