152238. lajstromszámú szabadalom • Eljárás ergolinvázas vegyületek előállítására bioszintézissel
152^38 Szacharóz 10 %, citromsav 1 %, KH2 P0 4 0,25%, MgS04 0,1 %, CaíNOs), 0,1 %. A közeg pH értékét vizes ammónia oldattal 5,6-ra állítjuk. A 110 C°-on 20 percig sterilezett táptalajt a Claviceps purpurea OKI 22/1963. sz. törzs háromnapos rázott tenyészetével oltjuk be és a fermentációt 24 C° hőmérsékleten, percenként 1 liter/liter térfogat levegő átáramoltatása mellett és percenként 330 fordulattal keverve, 6 napig folytatjuk. Az így kapott tenyészet papír- és rétegkromatográfiás elemzéssel vizsgálva főként ergometrint és ergokrisztinben dús ergotoxint emellett még chanoklavint, elimoklavint, penniklavint, ME—87 alkaloidot, szetoklavint, kosztaklavint és lizergsavat is tartalmaz. Ezek meghatározását rétegkromatográfiával végeztük az alábbi módon: A meglúgosított fermentléből a lizergsavat és az alkaloidokat kloroformmal kirázzuk, ezt az oldatot kloroform- 1% borkősavas víz rendszerben többszöri fáziscserével tisztítjuk, majd a komponenseket vékony rétegű alumíniumoxidon kromatografálva választjuk szét és afnfiindikátoros színreakcióval meghatározzuk. (Planta Med. 11, 169, 1963.). 1 ml fermentlé átlagban 100 meg ergotoxint és ergometrint, továbbá 20Ö , meg klavinalkaloidot és lizergsavat tartalmaz. 2. példa: 10 literes össztérfogatú fermentorban az 1. példa szerinti összetételű táptalaj 6 literét a Claviceps purpurea OKI 22/1963. törzs 3 napos rázott tenyészetének 600 ml-j ével oltjuk be. Percenként 0,5 liter/liter térfogat levegő átáramoltatása és percenként 350 fordulattal keverve 3 napig fermentálunk, majd a kapott tenyészet^ tel egy 300 liter össztérfogatú saválló fermentorban az alábbiak szerint előkészített és sterilezett 200 liter táptalajt oltjuk be: szacharóz 5,— %, aszparaginsav 1,-%, KH2 P0 4 0,025%, MgS04 0,025%, NH4NO3 0,1 %, CaCl2 0,06 %. 35 40 A táptalaj pH értékét vizes ammónia oldattal 5,4-re állítjuk. A sterilezést két lépésben, először a szacharóz hozzáadása nélkül 120 C°-on 30 percig, majd a szacharóz beadása után 106 C°-on 20 percig végezzük. A fermentort három napig járatjuk, a 6 literes fermentoréhoz hasonló keverés és levegőztetés mellett, majd a tenyészetet 5 m3 -es össztérfogatú saválló fermentorban az alábbi 3000 liter táptalajon oltjuk át: szacharóz io,- %, borostyánkősav 1,- %, Ca(N03 ) 2 0,1 o/o, KH2 P0 4 0,025%, MgS04 0,025%, CaCl2 0,012%. A közeg pH értékét vizes ammónia oldattal 5,6-10 ra állítjuk be. A sterilezés a 200 literes fermen. toréhoz hasonlóan két lépésben történik. A fermentációt percenként 1 liter/liter térfogat levegőmennyiséggel, percenként 280 fordulattal keverve, 24 C° hőmérsékleten, rendszeres hab-15 gátló adagolás mellett 7 napig folytatjuk. A fermentléből az alkaloidokat ismert módon kloroformba visszük át, majd ezt az oldatot A12 0 3 oszlopon kromatografáljuk. Benzollal, majd 1 :1 arányú metanol-kloroform eleggyel 20 eluáljuk. Az első frakciót benzolból kristályosítva, 54 g fehér kristályos port kapunk. Spec. forgatóképessége [«] 20D = —180° (c=l% kloroform). Az anyag további azonosítása céljából papírkromatográfiás elválasztást alkalmazunk, 25 amikoris az anyagot formamiddal impregnált Sch—Sch 2043/b papíron benzol és ciklohexán 1 :1 arányú elegyével futtatjuk. A papírkromatogramot ibolyántúli fényben kiértékelve egy erős és két gyenge pont látható. R/ értékek: 30 0,57—0,62—0,71. (Pharmazie 10, 422, 1955.) Az anyagot savas hidrolízisnek vetettük alá a következő módon: 10 mg anyagot tömény HC1-ban oldunk, majd ampullákba szétosztva és leforrasztva 16 órán át 100 C°-on tartjuk. Az ampullák bontása után a HCl-t lepároljuk és a száraz maradékot deszt. vízzel pépesítve 1 cseppnyi mennyiséget papírra viszünk. Sch—Sch 2043/b papíron n-butanol—jégecet—víz 4:1:5 arányú eleggyel fejlesztjük ki. A papírcsíkokat levegőn való szárítás után 0,2% ninhidriht tartalmazó 1:1 arányú n-butanol-kloroform elegygyel bepermetezzük, majd 1—2 percig szárítószekrényben 100 C°-on tartjuk, amikoris az aminosavfoltok előtűnnek. A vizsgálandó anyag-45 gal egyidőben standard aminosav mintákat is kromatografálunk; az ezekkel való összehasonlítás alapján az anyagban prolin mellett főképpen fenilalanin, ezen kívül valin és lfeucin mutatható ki. (J. Pharm. Pharmacol. 1, 802, 50 1949.) Fentiek alapján a termék ergokrisztinben dús ergotoxin-jbázisnak bizonyul. A második metanol-kloroformos frakcióból nyert terméket absz, etanolban oldva és maleinsav absz. etanolos oldatával elegyítve, 36 g fehér 55 kristályos port nyerünk. A termék spec, forgatóképessége [a] 20D = +53° (c=l%, vízben). A termék híg vizes oldatát ammónium oldattal erősen meglúgosítva kloroformmal kirázzuk, majd a kloroformos oldatot besűrítés után réteg-60 kromatogramon vizsgálva, kloroform —3%-os etanol kifejlesztőszer használata esetén 0,27 R/ értékű, szűrt ibolyántúli fényben fluoreszkáló foltot nyerünk. Ezek alapján a termék argometrin-maleátnak bizonyul (Planta Med. 11, 169, 65 1963.). k
