152173. lajstromszámú szabadalom • Eljárás heparin tartalmú szervkivonatok egyszerű letisztítására

3 komplexet hagy vissza. Ez utóbbi, részbeni fehérje-eltávolítás un. detergálás után még az enzimatikus emésztést is alkalmazni kell. Nagyüzemileg ezt általában szárított pankreásszal (pancreatin pulv.) érik el,' melynek viszont a saját oldható szöveti termékeiből is sok szennyeződés kerül az oldatba. Az ipari méretű proteolizisek kivitelezésénél pedig — szemben a laboratóriumi méretekkel — mindig nagyobb mennyiségű a visszamaradó elbontatlan komplex. Ez viszont részint a továbbfeldölgozást rendkivül megnehezíti, részint még a végterméket is szennyezheti. Azt találtuk, hogy a heparintartalmú kivonatokat — melyeket előzőleg a durva szennyeződésektől mentesítettünk — egy lépésben, a fehérje-heparinkomplex kvantitatív megbontásával lehet megtisztítani, ha az oldatban levő összes fehérjére számított fölös mennyiségű csersavoldatot adunk a kivonathoz és az elegy pH-értékét savval 2,5 és 4 közé állítjuk, amikoris az oldatban levő összes fehérje mennyiségileg lecsapódik és a megbontott komplexből a felszabadult heparin az oldatból közvetlenül kinyerhető. Az eddig használt eljárásoknál ugyanis több napig tartó emésztést követően is mindig 'marad vissza elbontatlan fehérje-heparinkomplex. Az emésztés befejeztével az enzimet hőkezeléssel koaguláltatni kell, majd az erősen savanyú közegben, a visszamaradó fehérje-heparinkomplexet triklórecetsawal vagy szulfoszalicilsawal kell eltávolítani és csak azután nyerhető ki az oldatból a heparin. A triklórecetsavas vagy szilfoszalicilsavas csapadékot általában újabb emésztésnek kell alávetni, vagy a következő tételhez gazdaságos hozzáadni. Az eddigiek analógiájára azt várbatnók, hogy a csersav hozzáadására is a fehérje-heparinkomplex válna le, mint az eddig alkalmazott szerves savak esetében, ezzel szemben meglepő módon a komplex megbomlása és a fehérjék mennyiségi leválása következik be, ami lehetővé teszi a heparin tiszta állapotban való kinyerését. Csersavként, mind a kereskedelmi forgalomban levő acidum tannicum, acidum gallotannicum elnevezésű tisztított termék, mind a növényi drogokból előállított kivonatok, azok bekoncentrált termékei, vagy egyéb digaJlussavgyököt tartalmazó vegyület felhasználható. A találmány szerinti eljárásban a csersav feleslege nem zavaró, mdvel ez az: alkoholos oldattal együtt a rendszerből eltávolítható. Így elkerülhető a több napot igénybevevő/ emésztési művelet, mely a nagyiparilag is nehezen megoldható lépések egyike. A találmány szerinti eljárás, feleslegessé teszi az enzimek felforralással történő eltávolítását, valamint a további kicsapási műveleteket, melyeknél fehérje kicsapó szerékkel, mint pl. triklóreoetsavval kell a megbontatlan fehérje-iheparinkomplexet leválasztani. Az eljárás előnyei között szerepel még az, hogy a csersav anorga-4 nikus szennyeződésektől, pl. a III. analitikai osztályba tartozó fémektől, mint Fe, Ni, A] stb. is mentesíti az oldatot. A találmány szerinti eljárás kiválóan alkal-5 mas kereskedelmi forgalomban levő leszárított közti termékek, úgynevezett crudüm termékek közvetlen letisztítására is. A vízben oldott és pH 4-re pufferolt közegben levő heparin crudüm termékhez, mely általában 30 ÍNE/mg ak-10 tivitású és részben még fehérjetartalmú, állandó keverés közben csersavat tartalmazó oldatot öntünk. Az oldatban levő szabad állapotú peptidekből és fehérjékből, ill. a fehérjeheparinkomplexből, mely utóbbi a jelzett raó-15 don megbomlik, jól ülepedő csapadék képződik. Ezt követően rövid állás után a lecentrifugált szupernatánst pH 7-re állítjuk, 1% konyhasót oldunk benne, majd azonos térfogatú alkohollal a benne levő heparint kicsap-20 juk. A szeparált csapadékot peroxidos kezelésnek vetjük alá és a jelenlevő egyéb szenynyeződésektől valamilyen sóképzésen keresztül, előnyösen bárium-ion alkalmazásával megszabadítjuk. A ibáriumsó megbontása után nát-25 niumsót alakítunk ki, majd alkoholos frakcionálás után ebből igen magas aktivitású heparint nyerhetünk ki. Az eljárás részleteit és alkalmazásának előnyéit az alábbi példák szemléltetik. 30 1. példa: 300 g centrifuga-nedves fehérje-heparin csapadékot, — melyet állati szervekből vizes 35 extrakció utáni savas kicsapás és részbeni fehérje-mentesítés után nyertünk — súlyára számított hétszeres térfogatú vízzel szuszpendálunk. A jelen kiindulási termék összesen kb. 2 millió NE heparint képvisel. Az előnyö-40 sebb beoldás biztosítására a vizes oldat pH-ját 2n NaOH-dal pH 7,5—8,5-re állítjuk be turmix készülékiben való keverés közben, majd 210 ml 15%-os csersav-oldatot öntünk hozzá. Az oldat pH-ját egyidejűleg 2n HCl-el pH 4-45 re állítjuk. Eközben voluminózus csapadék leválását észlelhetjük. Félórai várakozás után a kivált csapadékot centrifugán eltávolítjuk. A csapadékon adszorbeálódott heparint pH 4-re állított, 700 ml 50 0,5—1 százalékos csersav-oldattal átmossuk, majd újból centrifugáljuk. Az egyesített tükrösen tiszta szupernatánsból pedig 1% konyhasó jelenlétében, pH 7-re való semlegesítés után, azonos térfogatú, kb. 3 liter alkohollal 55 a heparint, 15 C°-ot meg nem haladó hőmérsékleten, kicsapjuk. Az elkülönülő heparint centrifugálással -elválasztjuk, 400 ml deszt. vízben feloldjuk, 2n NaOH-dal pH-ját 8,5—9-re állítjuk, 15 ml 60 30%H>S H2O2 oldattal 6—8 óráig szobahőmérsékleten állni hagyjuk. Időnkénti felkeverések alkalmával az oldat pH-ját egyidejűleg korrigálni kell. A kivált mukózus csapadék eltávolítására legjobb a centrifugálás. Az így 85 nyert tükrösen tiszta oldat pH-ját ezután jég-2