152000. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 17alfa-hidroxi-11-deoxikortikoszteron mikrobiológiai előállításának optimális kivitelezésére
3 és így az oldatba vitt szteroidokat, vagyis a szubsztrátumiot, a közbenső terméket és az előállítandó terméket kénsavval reagáltatjuk, majd a kénsavas reakcióteranékek fényelnyelését megmérjük a szubsztrátiumra, a közbenső termékre és az előállítandó termékre jellemző hullámhosszokon, az egyes szteroidkoncentráció értekeket ismert módon kiszámítjuk, és az átalakítási folyamatot a minimális szuibsztrátumszint, ill a minimális közbenső termékszint és a maximális 17ö-ihidroxi-ll-deoxikortifcoszteroinszint kialakulásának pillanatában vagy ahhoz közeli időpontban állítjuk le. A találmány szerinti eljárás egy előnyös foganatosítási .-módja szerint 50—60i: 40—50 *térfogatarányú alkohol tömény kénsav elegyet alkalmazunk reagensként, és a kénsavas reakciót 5—30 perc reakcióidő alatt és 30—50 C° hőmérsékleten hajtjuk végre. A fermentációs közegben jelenlevő szteroidkomponensek mennyiségeit a kénsavas reakciótermékek koncentrációinak két, ill. három hullámhosszon, előnyösen 290 és 410 nm, ill. 290, 410 és. 530 nm hullámhosszon végzett fényabszorpciós •mérése útján célszerű meghatározni. A találmány értelmében célszerűen úgy járunk el, hogy a mikrobiológiai szteroid-átalakítás folyamán a fermentációs folyadékból megfelelő sűrű időközökben mintát veszünk, és abból a szteroidok mennyiségét a fenti módon meghatározzuk. Amidőn a szubsztrátum, ill. a közbenső termék esetében a. megkívánt értékesökikenés bekövetkezik, és az előállítandó 17a-hidroxi-l 1-deoxikortikoszteron optimális koncentráció értéket ér el, a fermentációs folyamatot leállítjuk, vagyis a keverést megszüntetjük:, és a szteroidokat extrakcióval az organizmustól elválasztj uk. A találmány szerinti eljárás foganatosítására az alábbi kiviteli példákat adjuk meg. 1. példa: (Szubsztrátum:: 3ß, 17",21 -tri'hidroxi-pr egn~5-én-20-on) Az eredetileg 400 //ig/ml szu!bsztrátum-koncentrációjú fermentációs folyadékból megfelelő időközökben (az átalakítás előrehaladtával kb. óránként) vett minta 10 ml-ét üvegdugós centrifugacsőben 20 ml etilénkloriddal összerázzuk. Centrifugálás után a kiextrahált, felülúszó fermentációs folyadékot eltávolítjuk, majd a szerves fázist vízmentes nátriumszulfáttal víztelenítjük. A szteroidtartalmú etüénkloridos oldat 1 ml-ét üvegdugós kémcsőben szárazra pároljuk. Hozzáadunk 6 ml 40 C°-os olyan reagenst, amelyet jéghűtés közben 55 térfogat 96%-os etilalkohol és 45 térfogat koncentrált kénsav elegyítésével készítünk. A szárazmaradékot ezen reagensben rázogatás közben feloldjuk, majd a kémcsövet 15 perc időtartamra 40 C°•os termosztátba helyezzük. Jeges vízben történő hűtés után az oldat fényelnyelését <(ex-4 tinkció) ^ = 290 és 410 'nm-nél 1 cm rétegvastagság mellett, a reagenssel mint vakoldattal szemben megmérjük. A fenti hullámhosszakon kapott extinkciós értékekből a, szubsztrátum 5 nélküli fermentációs folyadék (adagolás előtti fermentációs, folyadék) esetében kapott értéket levonásba hozzuk. Az így korrigált extinkció értékből .a szubsztrátum, ill.' a keletkezett 17a-hidroxi-11-deoxikortikoszteron mennyiségét 10 ' irodalomban (ISiggis, S. és Stolten, H. J.: An Introduction to Modern Organic Analysis, 86. old.) [Intierscienoe Publishers, New York, (1956)] ismertetett módon kiszámítjuk. Ha a szteroid átalakítást mikroorganizmu-15 sokkal, vízzel korlátoltan elegyedő szerves oldószer jelenlétében végzik, a meghatározást a szerves fázisból kiindulva végezzük el úgy, hogy az. abból vett mintát vízmentes nátriumszulfáttal víztelenítjük, majd a Ibepárlást és a 20 további műveleteket a fenti módon végezzük el. 2. példa: 25 (Szubsztrátum: 17«Hhidroxi-3^,21-diacetoxipr egn-5- én-2 0-on) Az eredetileg 400 /tg/ml szubsztrátum kon-30 centrációjú fermentációs folyadékból megfelelő időközökben vett minta 10 ml-ét üvegdugós centrifugacsőben 20 ml etilénkloriddal összerázzuk. Centrifugálás. után <a kiextrahált felülúszó fermentációs folyadékot eltávolítjuk, majd 36 a szerves, fázist vízmentes nátriumszulfáttal víztelenítjük, Az etilénkloridos oldat 1 ml-ét vízfürdőn bepároljuk. A szárazmaradékhoz 6 ml 40 C°-ra előmelegített 55 térfogat 96%-os etilalkohol és 45 térfogat koncentrált kénsav 40 elegyítésével készült reagenst adunk. A kémcső tartalmát ezután 15 percre 40 C°-os termosztátba helyezzük. Hűtés után az oldat fényelnyelését (extinkció) ^ = 290, 410 és 530 nm-nél 1 cm-es rétegvastagság mellett a reagenssel, 45 mint vakoldattal szemben megmérjük. A kapott extinkció értékeikiből a szteroidkoncentrációkat kiszámítjuk. Ha 1 Ta-Jhidroxi-l 1-deoxikortikoszteranHacetát^ tal előzetes adaptáltatás történik, abban az 50 esetben adaptálás után és a szubsztrátum adagolása előtt a fermentációs folyadékból a fenti módon meghatározást végzünk, és a kapott extinkcióértékeket az előbbi mérésnél korrekcióba vesszük. Szabadalmi igénypontok: 1. Eljárás 17a-hidroxi-ll-deoxikortikoszteron 60 mikrobiológiai előállításának optimális kivitelezésére, a fermentációs átalakítás folyamata alatt a szteroidok mennyiségeiben bekövetkező változásoknak sűrű időközökben vett minták segítségével történő meghatározása útján, 65 amelyre jellemző, hogy a mintát vízzel kor-2