151959. lajstromszámú szabadalom • Eljárás oxitocin előállítására

3 151959 4 Oxitocin összes közti terméke jobb kristályosodási készséget mutat az irodalomban leírtnál és ezáltal könnyen és nagytisztaságban állítható elő. Ezt bizonyítja pl. a Pro—Leu—Gly tripeptidamid előállítása, melyet a fenti védőcsoport alkalmazásával 132 C°, tehát az irodalomban leírtnál több mint 10 C°—kai magasabb olvadásponttal nyertük. (R. Boissonnas loc. cit.) A maximális optikai tisztaság elérése céljából jelen eljárásban ott, ahol egyéb kapcsolási módszerek pl. diciklohexil-karbodiimid (1. H. C. Beyerman loc. cit., valamint L. Velluz loc. cit) alkalmazása mellett a racemizáció nem kerülhető el, az azidos kapcsolási módszert alkalmaztuk, melynél az eddigi tapasztalatok szerint a racemizáció kivédhető. Ily módon eljárásunk az összes irodalmi szintézissel szemben a legtöbb azidos kapcsolási módszert alkalmazza oly, az irodalomban nem ismert módosított formában, mely segítségével nagyobb mennyiségek előállítása is lehetővé válik. Ennek lényege, hogy az érzékeny azidot nem preparáljuk ki (1. R. Boissonnas loc. cit.), mert felismertük, hogy a kapcsolás homogén dimetilformamid-vizes oldatban, jó termeléssel elvégezhető. Az érzékeny azidok készítése közben ui. különösen nagyobb mennyiségek esetében, számos nem kívánatos mellékreakció játszódik le, melyek nemcsak a termelés csökkenését eredményezik, hanem a .végterméket nehezen eltávolítható melléktermékekkel is szennyezik (vö. E. Schnabel-, Annalen 659. 190/1962)]. További új felismerésünk volt az N-terminális tripeptid, a Cy—Tyr—Ileu maximális tisztaságának döntő szerepe a végtermék tisztaságában. Mivel ismeretes [B. Riniker, R. Schwyzer Helv. Chim. Acta 44. 658 (1961)], hogy tirozin-végű dipeptiddel történő acilezéskor esetenként 30%-ban keletkezik racém termék, ezért ehelyütt is a fenti módosított azidos kapcsolást alkalmaztuk. Végül felismertük, hogy a védett nonapeptidamid egyszerű módon megszabadítható mindazoktól a kisebb molekulasúlyú melléktermékektől, amelyek inhibiciós hatást fejthetnek ki a már kész Oxitocin oldatban, ha a védett nonapeptidamidot valamilyen R—OH általános képletű alkohollal (ahol R alkil- vagy aralkil-csoportot jelent) a forráspont hőmérsékletén kezeljük. A védőcsoportjaitól megszabadított nonapeptidamid gyűrűzárását az először általunk alkalmazott és itt is a legcélszerűbbnek bizonyult hidrogénperoxidos oxidációs módszerrel (vö. Bajusz S., Kisfaludy L., 146.631 sz. magyar szab. leírás) valósítjuk meg. A találmány tárgyát tehát olyan új eljárás képezi nagy biológiai, aktivitású szintetikus Oxitocin üzemi méretekben történő előállítására, amelynek során a nonapeptid-molekulát, ín, az eddig alkalmazott közbenső termékeknél lényegesen jobban kristályosítható és tisztítható és így nagyobb kémiai és optikai tisztaságban nyerhető védett tripeptidekből, a p-klórkarbobenzoxi-L-prolil-L-leucil-glicinamidból, p-klórkarbobenzoxi-L-^'itaminil-L-aszparaginil-S-benzil-L-ciszteinil-hidraz:idból és p-klórkarbobenzoxi-S-benzil-L-ciszteinil-L-tirozil-L-izoleucil-hidrazidból építjük fel, mimellett ezek kapcsolására — és részben már ezek előállítására is — az 5 azidos módszer egy új, a nagy méretekben való dolgozást lehetővé tevő alakját alkalmazzuk és a kapcsolási reakciók termékeként kapott védett nonapeptidamidot egy ugyancsak új specifikus módszerrel, alkoholos forralással mentesítjük a 10 termék aktivitását lerontó melléktermékektől. Az eljárásnak ezek az új mozzanatai igen lényeges műszaki előnyöket biztosítanak: az eddig ismert eljárásokkal nyerhető, du Vigneaud és Boissonnas (loc. cit.) által megadott 80 NE-mg 15 aktivitású oxitocinnal szemben az új eljárással 180—200 NE/mg aktivitású terméket állítunk üzemi méretekben elő. A fentiek értelmében tehát az Oxitocin szintézise a találmány szerinti eljárással lényegileg 20 az alábbi módon történik: Kristályos p-klór-karbobenzoxi-L-leucint glicinészterrel kapcsolunk, a kapott dipeptidésztert védőcsoportjától megszabadítva p-klórkarbobenzoxi-L-prolinnal kapcsoljuk és a nyert vé-23 dett tripeptidésztert ammonolízisnek vetjük alá, ily módon a p-klór-karbobenzoxi-csoport eltávolítása után a kristályos L-prolil-L-leucil-glicinamidhoz jutunk, amelyet azután a p-klór-karbobenzoxi-L-glutaminil-L-aszparaginil-SZ'J -benzil-ciszteinil-hidrazid védett tripeptiddel kapcsolunk; ez utóbbit úgy nyerjük, hogy p-klór-karbobenzoxi-L-aszparagint S-benzil-L-cisztein-metilészterrel kondenzálunk, célszerűen o-fenilén-klórfoszfit kondenzálószer jelenlétében, 35 majd a védőcsoport eltávolítása után a terméket p-klór-karbobenzoxi-L-glutaminnal kapcsoljuk és a nyert védett tripeptidésztert hidraziddá alakítjuk; a fenti két tripeptid kapcsolása útján nyert védett hexapeptidamidot védőcsoport já-40 nak eltávolítása után a p-klór-karbobenzoxi-S-benzil-L-ciszteinil-L-tirozil-L-izoleucil-hidrazid N-terminális tripeptiddel kapcsoljuk, mely utóbbit úgy nyerünk, hogy S-benzil-N-p-klórkarbobenzoxi-L-ciszteint vagy ennek ciánmetilészterét 45 L-tirozin-metilészterrel kapcsolva, a kapott védett dipeptidésztert hidraziddá alakítjuk és L-izoleucin-metilészterrel kondenzáljuk; a hexapeptidamid és a tripeptidhidrazid kapcsolása útján nyert védett nonapeptidamidot egy R—OH 50 általános képletű alkohollal (ahol R alkil- vagy aralkilcsoportot jelent) forralva mentesítjük főbb szennyezéseitől, majd a védőcsoportokat eltávolítva, a nönapeptidet hidrogénperoxiddal oxitocinná oxidáljuk. Eö A fent vázolt eljárás valamennyi közbenső terméke új vegyület; ezek az új közbenső termékek — amint ez a példákban megadott elemzési értékekből is látható — analitikailag tiszta állapotban könnyen előállíthatók; ennek köszön-C0 hető, hogy a végtermék mindenféle bonyolult és veszteséges tisztítási művelet nélkül igen magas fajlagos aktivitást mutat. A termék nagy optikai tisztasága elsősorban annak köszönhető, hogy a racemizálódás elkerülésére leginkább al-65 kalmas azidos kapcsolási módszert egy új, a 2