151621. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hirudin kinyerésére orvosi piócából

151621 1. táblázat Hirudin előállítása Markwardt szerint El j arás összaktivitás specifikus veszteség szarazsúly ""« aktivitás % g Mio ATE* /0 10 000 db orvosi piócafej absz. alkoholban víztelenítése és felaprítása 40%-os vizes acetonnal extrakció, és frakcionált kicsapás Elektrodialízis Acetonos kicsapás n-propanollal való extrakció, liofilizálás Papírelektroforézis, liofilizálás 375,0 4,875 13 4,40 3,108 700 2,39 2,868 1200 0,94 2,350 2500 0,135 1,147 8500 36,1 41,0 51,8 76,5 * antithrombin-egység hetjük, mimellett az inaktív nagymolekulájú kísérő anyagokat leválasztjuk. Az így nyert közbenső termék specifikus aktivitása 1300 ATE/mg, a hozam pedig a bevitt nyers hirudinra számítva eléri a 90%-ot. A találmány szerinti eljárással lehetővé válik az, hogy a hirudint makacsul követő színező és kis molekulasúlyú szennyeződéseket oxicellulózon való adszorpció útján eltávolítsuk. Az így előtisztított hirudin végső tisztítását gyengén savanyú kationcserélő gyantán való adszorpcióval, célszerűen Wofatit CP műgyantával végezzük. A megtisztított termék specifikus aktivi-25 30 tása kb. 4500 ATE/mg. A hozam a bevitt nyers hirudinra számítva 80%. Természetesen lehetővé teszi a találmány szerinti eljárás azt is, hogy nemcsak a már kinyert nyers hirudint tisztítsuk, hanem a piócaban levő hirudint is kinyerjük. Ilyen esetekben a hozam mintegy 72%, a termék specifikus aktivitása pedig szintén kb. 4500 ATE/mg. A következő 2. táblázat tartalmazza a találmány szerinti eljárás egyes fázisait, a közbenső termékek specifikus aktivitását, valamint a fellépő veszteségeket. 2. táblázat Hirudin előállítása a találmány szerinti eljárással Módszer száraz- összaktisúly vitás Mio ATE specifikus veszteség aktivitás % 10 000 db orvosi piócafej absz. etanolban víztelenítése és felaprítása 40%-os acetonnal való extrakció A kísérőanyagok kicsapása, acetonos kicsapás A nyers hirudin oldat frakcionált etanolos kicsapása A pigmensanyagok adszorpciója oxicellulózon, a hatóanyag adszorpciója, kationcserélő gyantán, eluálás és liofilizálás 380,0 0,80 5,00 9,00 4,50 3,12 4,05 3,60 13 — 500 10 1300 19 4500 28 1. példa: 55 a) A nyers hirudin kinyerése 10 000 db orvosi piócafej et abszolút etanolban víztelenítjük, megszárítjuk és felaprítjuk. 60 Ezután egyszer tízszeres mennyiségű, majd egyszer ötszörös mennyiségű 40%-os vizes acetonnal 40 C°-on fél óra hosszat extraháljuk. A kísérőanyagok kicsapása végett az egyesített kivonatokat fele térfogatra (80%-os vizes 65 acetonra) töményítjük. Jégecet hozzáadásával 4,3—4,5 pH értéket állítunk be. A képződő csapadékot lecentrifugáljuk és elöntjük. A hatóanyagtartalmú oldatot hígított ammóniás oldattal 6 pH értékre állítjuk be és vákuumban 40 C°-ot meg nem haladó hőmérsékleten eredeti térfogatának egytizedére bepároljuk. Az így kapott sűrítményt térfogatára számított 60%, 10% triklórecetsavat tartalmazó acetonnal elegyítjük, mikoris az oldat pH értéke 1,8 lesz. Ebből az oldatból csapjuk ki a nyers hirudint, a be-