151621. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hirudin kinyerésére orvosi piócából

MAGYAR NÉPKÜZTÁRS AS AG ORSZÁGOS TALÁLMÁNYI HIVATAL SZABADALMI LEÍRÁS 151621 Bejelentés napja: 1963. V. 15. (AE—148) Német Demokratikus Köztársaság-beli elsőbbsége: 1962. XII. 18. Közzététel napja: 1964. IV. 25. Megjelent: 1965. IX. 01. Szabadalmi osztály: 30 h 1—8 Nemzetközi osztály: A 61 k Decimal osztályozás: Feltalálók: Dr. Dr. Markwardt Fritz professzor, Erfurt, Dr. Walsmann Peter oki. vegyész, Erfurt, Dr. Schäfer Gerhardt oki. vegyész, Radebeul, Töpfer Horst oki. vegyész, Radebeul, Nemet Demokratikus Köztársaság Tulajdonos: VtEB Arzneimittelwerk Dresden cég, Radebeul, Német Demokratikus Köztársaság Eljárás hirudin kinyerésére orvosi piócából 1 A találmány eljárás az orvosi pióca véralvadásgátló hatóanyagának, a hirudinnak kinyerésére. Ismeretes az, hogy az orvosi pióca, — Hirudo medicinalis — olyan gátlóanyagot tartalmaz, 5 mely specifikus módon épül be a véralvadás folyamatába. Ez a gátlóanyag az alvadásgátló enzimmel, a thrombinnal, gyakorlatilag nem disszociáló és sztöchiometrikusan definiálható komplexet képez, miáltal a thrombin hatását 10 megszünteti. A hirudin sokszor tárgyalt anyagát képezi a kémiai és fiziológiai szakirodalomnak. Az irodalomban fellelhető ismertetések azonban inkább tájékoztató jelleggel bírnak. A hirudin 15 kémiai-fizikai tulajdonságai nem váltak ismeretessé, mivel tiszta formában nem sikerült kinyerni. Elsőízben 1957-ben közölte F. Markwardt, hogy a hirudin tiszta formában való kinyerését sikerült megoldania, ennek alapján 20 pedig megállapítható, hogy kismolekulasúlyú polipeptidnek felel meg. A hirudin kinyerésére az egyik ismert eljárás szerint az abszolút etanolban víztelenített piócafejeket vizes acetonnal extrahálják, majd 25 frakcionált acetonos kicsapás útján olyan nyersterméket kapnak, amelyet tovább kell tisztítani. A nyerstermék továbbtisztításánál elektrodialízist, propanolos extrakciót, végül papíréi ektroforézist alkalmaznak. Bár ezzel az eljá- 30 rással elektroforétikusan egységes hirudint nyernek, mégsem alkalmas ez az eljárás ipari előállításra. Főként a tisztítás elektroforétikus szakasza jár nehezen leküzdhető nehézségekkel, ui. ennek során az előzőleg megjelölt és kivágott, hirudint tartalmazó zónák eluálását nehéz megoldani. Az eljárás lefolytatásánál természetesen jelentős mértékű veszteségekkel kell számolni, ennek megfelelően a hozamok nem haladják meg, az orvosi piócában levő hirudinra számítva, az elméleti érték 25%-át. Gazdasági szempontokat tekintetbe véve tehát ez az eljárás nem alkalmas a hirudin gazdaságos előállítására. A hirudin kinyerésének folyamatát, az egyes frakciók specifikus aktivitását és a fellépő veszteségeket az 1. táblázaton szemléltetjük. A találmány értelmében azt tapasztaltuk, hogy a feldolgozás első fázisában fellépő nagy aktivitásveszteség messzemenően kiküszöbölhető, ha a kísérőanyagok leválasztását erősen felhígított, a nyers hirudin kicsapását pedig alig hígított extrakciószerrel egymást követően végezzük. A hirudinra számított hozam ezáltal 90% feletti értékre emelhető. Azt találtuk továbbá, hogy ha a mintegy 500 ATE/mg aktivitású nyers hirudint több ízben vízzel elegyedő hűtött oldószerrel, célszerűen etanollal, több ízben kicsapjuk, akkor a hirudin tisztasági fokát jelentékeny mértékben növel-151621