151420. lajstromszámú szabadalom • Eljárás proteolitikus enzimek előállítására

151420 13 14 gyobb enzim-hozamot abban az esetben értük el, ha a táptalaj 1—1,5% fehérjét tartalmazott, mimellett fehérjeforrásként szójalisztet vagy mogyorólisztet alkalmaztunk; emellett a táptalajban 2—4% szénhidrát, valamint magnézium- és'foszforsók jelenléte bizonyult legelőnyösebbnek. A sterilizált táptalaj kezdeti pH-értéke 6,5 és 7,0 között volt. Az optimális enzim-aktivitást rendszerint 3—4 nap alatt értük el. . • Bőséges spóraképződés 'bekövetkezte után a proteolitikus enzimek kiszabadultak korábbi sejtközi állapotukból és mennyiségileg kinyerhetők voltak a táptalajból. Ebben az állapotban kell a terméket kinyerni, mert különben az enzim-hatásosság a további inkubálás során tapasztalataink szerint számottevő mértékben csökken. A kultúrából leszűrt fermentlevet tanninnal való lecsapás útján koncentráltuk. '2. példa: A proteolitikus enzimek lecsapása tanninnal Az előző példában leírt eredmények alapján a fehérjék koncentrálását az alábbi módon végeztük: A kultúra szüredékét 5,5 pH-értékre állítottuk be. A fehérjék főtömegét azután oly módon csaptuk le, hogy az oldathoz lassan 10%-os tanninpldatot adtunk, mindaddig, míg a végső tannin-koncentráció 1000 ml szüredékre szá-. mítva 3,0 g-ig nem emelkedett. Nagytömegű csapadék képződött, ezt legalább 2 óra hosszat ülepedni hagytuk, majd centrifugálással elkülönítettük és a tannintól oly módon mentesítettük, hogy a csapadékot a centrifuga-edényekbén acetonban diszpergáltuk és újból centrifugáltuk, végül pedig vákuumban megszárítottuk. Azt tapasztaltuk, hogy a proteolitikus enzimek a lepcsapási és újbóli kinyerési műveletek után is megtartják enzim-aktivitásukat. Az eredeti proteolitikus aktivitás 80—10Ó%-át nyertük vissz'a, az eredeti kultúra-szüredék vizsgálata útján kapott értékre számítva. 3. példa: Szelektív adszorpciós eljárás a proteázok szétválasztására . Azt találtuk, hogy a proteolitikus enzimeket számottevő aktivitás-veszteség nélkül lehet adszorpciós és eluálási műveletek útján a nyers proteáz-öldatokból elkülöníteni. Az általunk alkalmazott módszer, amelyet vázlatosan a 4, ábra szemléltet, nemcsak az egyes proteázok egymástól való elválasztására bizonyult alkalmasnak, hanem előnyösen alkalmazható volt az egyes proteázokat kísérő szenynyezések legnagyobb részének eltávolítására is. A módszer igen gyors és ipari méretekben is kivitelezhető. Adszorbensként karboximetilcellulóz kationcserélőt alkalmaztunk, amelyet Peterson és Seber módszere szerint állítottunk elő Whatman-féle cellulózporból klórecetsavval, vagy pedig készen szereztünk be a kereskedelemben. A különböző adagok, amelyek 1 g karboximetil-cellulózra számítva 0,7—0,9 milliekvivalens karboxilcsoportot tartalmaztak, mind egyformán viselkedtek az elválasztási műveletek során; nagyon fontosnak bizonyult, hogy a gyanta pH-értéke ugyanakkora legyen, mint a kezelendő proteáz-oldaté. Ezért az adszorbens különböző adagjait ugyanúgy tompítottuk a megfelelő pH-értékre, mint ezt fentebb a dietilaminoétil-cellulóz esetében leírtuk. Ezzel az eljárással bármely, Aspergillus oryzae kultúrából nyert nyers proteáz-oldat kezelhető volt; így az eljárás jól alkalmazható volt bármilyen fajta alámerülő kultúrából kapott kultúra-szüredék feldolgozására. A legtöbb esetben azonban tanninnal történő lecsapás útján nyert nyers proteáz-elegyeket használtunk fel, 500 g tanninnal lecsapott proteáz-elegyet 250 liter vízben vagy 5,5 pH-értékű 0,01 mólos foszfát-tompítóoldatban oldottunk. A pH-értéket — amennyiben ez szükséges volt — 5,5-re állítottuk be, majd 500 g karboxicetilcellulózt adtunk hozzá, amelyet előzőleg ugyanilyen pH-értéken egyensúlyba állítottunk. Az elegyet szobahőmérsékleten 1 óra hosszat kevertük, majd az adszorbeált fehérjét is tartalmazó ioncserélőt centrifugálással,. kosaras centrifuga alkalmazásával különítettük el az oldat főtömegétől. A cellulóz-ioncserélő azonban nagy menynyiségű oldatot tartalmazott még a centrifugálás után is és ebben a visszatartott oldatban reagálatlan fehérjék és egyéb anyagok voltak jelen. Ezért a nem-adszorbeált anyag eltávolítása céljából az ioncserélőt 0,01 módos foszfát-tompítóoldattal ú,ú pH-értéken mostuk. Az egyesített oldat pH-értékét sósavval 4,5-re állítottuk be. A II proteázt 500 g 4,5 pH-értékre tompított karboximetil-cellulózon adszorbeáltattuk. A művelétet a fentebb leírthoz hasonló módon végeztük. Ezután az oldatot 3,0 pH-értékre állítottuk be és további 500 g, 3,0 pH-értékre tompított karboximetil-cellulózon adszorbeáltattuk a proteáz-elegy harmadik alkotórészének megkötése céljából. Az ioncserélőn megkötött proteázok kinyerése bármely olyan tompítóoldattal történhet, amelynek pH-értéke nagyobb az adszorpció során fennállott pH-értéknél. A legtöbb esetben az elsőnek adszorbeált két proteázt 0,05 mólos roszfát-tompítóoldattal, 7,0 pH-értéken eluáltuk, míg az utolsó proteáz eluálására 6,0 pH-értékű oldatot alkalmaztunk. Ismételt eluálással az eredeti proteázoknak és azok aktivitásának 90%-ot meghaladó része volt kinyerhető. Az eluálás megtörténte után a karboximetilcellulózt oly módon regeneráltuk, hogy az adszorbenst először 0,5 mólos koncentrációban nátriumkloridot és ugyanilyen koncentrációban nátriumhidroxidot tartalmazó oldattal mostuk, azután a mosást semleges kémhatásig vízzel folytattuk, 10 15 20 25 30 35 40 45 5p 55 60 7