151389. lajstromszámú szabadalom • Eljárás C-cephalosporin-származékok előállítására

151389 Az így kapott port 3 ml vízben oldjuk és az oldat pH-értékét 0,1 n nátriumhidroxidoldat hozzáadása útján 7,9-re állítjuk be. További 10 ml vizet adunk ezután hozzá és az oldatot fagyasztva szárítjuk. A fagyasztva szárított termieket, amely a dezacetil-C-cep'halosporin nátriumsója, vizes etanolból kristályosítjuk. 3. példa: 10 80 narancsot lehámozunk; a kapott narancshéj súlya 1334 g. A megreszelt narancshéjat 100 g savval mosott homokkal és 20 g nátriumkloriddal keverjük, majd sajtszűrő kendőn átsajtoljuk. Az így kapott levet nátriumoxaláttal 15 telítjük, majd Whatman 42 sz. szűrőpapíron, csupán gravitációs hatással szűrjük. Az így kapott 310 ml kivonatot ugyanekkora térfogatú telített ammóniumszurfátoldattal elegyítjük és a képződött csapadékot 15 percig centrifugáljuk 20 percenként 2000 fordulattal. Az így elkülönített csapadékot 60 ml 0,1 mólos nátriumoxalát oldatban újból szuszpendáljuk, majd 5 C° hőmérsékleten éjjelen át dializáljuk, 0,1 mólos nátriumoxalát-oldatta] szemben. 25 1,8 g C-cepbalosporin-nátriumsót 9 ml vízben oldunk és ezt az oldatot 15 ml fenti módon elkészített és előzetesen 6,5 pH- értékre beállított citrus-acetileszteráz oldattal kezeljük. Az elegyet keverés közben a 6,2 és 6,9 közötti pH- 30 értéken tartjuk, 0,1 n náiriumhidroxidoldatnak a szükséges adagokban való hozzáadása útján. Amikor az alkáli-hozzáadás üteme már lelassult, további 15 ml előzetesen 6,5 pH-értékre beállított enzim-oldatot adunk hozzá és az ele- 35 gyet 30 C° hőmérsékletre melegítjük. Amikor már 33,7 ml 0,1 n nátriumhidroxidoldat került hozzáadásra, a reakció csáknem megszűnt (az elméletileg szükséges 0.1 n nátriumhidroxidoldat mennyisége 34,0 ml). A felvett bio- 40 autogram azt mutatja, hogy csupán egy aktív folt van jelen, amely a dezacetil-C-cephalosporinnak felel meg. A reakcióelegy fő tömegét 2 n ecetsavoldattal 5,0 pH-értékre állítjuk be, majd egy 4,0 pH-értékre tompított Xe—58 ion- 45 cserélő gyantával töltött 21X2,5 cm méretű oszlopra visszük. Az oszlopot ezután piridinnel 5,0 pHértékre tompított 0,3 mólos ecetsavol dattal eluáljuk. 5 ml-es frakciókat fogunk fel az oszlopról és ezek 0,1 ml-es mintáit vizsgáljuk 50 ninhidrin-Bzínreakcióval, Moore és Stein !(J. Biol. Chem., 176, 367, 1948) módszere szerint. Az aktivitás csúcsértékét a 66. és 101. frakció között tapasztaljuk. E frakciókat egyesítjük és liofilizáljuk. A kapott, szilárd terméket 10 ml 55 vízzel felvesszük és 200 ml aceton hozzáadása útján ismét lecsapjuk. A kapott olajszerű termék vákuum alatti enyhe bepárlás hatására megszilárdul. Ezt a szilárd terméket eentrifugálással {1500 fordulat/perc, 15 percig) elkülönít- 60 jük, majd 50 mi vízmentes aceton alatt finomra őröljük. A szilárd terméket szűréssel elválasztjuk, 10 ml vízben oldjuk és 0,1 n nátriumhidroxidoldattal 7,9 pH-értékre állítjuk be. Az így kapott demcetil-C-cephalosporin-nátriumsó ol- 65 datot liofilizáljuk, amikor is 526 mg liofilizált terméket kapunk. Ezt vizes etanolból kristályosítva 342 mg oly terméket kapunk, amely bioautográfiai úton vizsgálva csupán egyetlen foltot mutat, amely a dezacetil-C-cephalosporinnak felel meg. A kapott dezacetil-C-cephalosporin hatóképessége: a C-cephalosporin • mikroorganizmus: hatóképességének °Va: B. subtilis C 289 Staph, aureus C 864 V. Chol er ae C 833 58,0 23,0 22,9 4. példa: 52 meg 7-fenilácetamido-cephalosporánsav-nátriumsót 0,2 ml vízben oldunk. Ebből az oldatból 0,1 ml-t elveszünk, 0,1 ml oly citrus-acetileszteráz oldattal elegyítjük, amelyet mólos foszfát-tompítóoldattal előzetesen 7,4 pH-értékre tompítottunk, majd az elegyet 30 C'~ hőmérsékleten inkubáltatjuk 1 óra hosszat. Ebből az oldatból 0,01 ml-es mintákat és az, eredeti oldatból 0,005 ml-es mintákat viszünk fel ezután egy eléktroíorézis céljaira szolgáló papírlapra. A C-cephalosporin egy mintáját alkalmazzuk jelzőként és az így előkészített papírlapot szobahőmérsékleten megszárítjuk. Ezután a lapra 7,0 pH-értékű mólos piridinacetát-oldatot permetezünk, szobahőmérsékleten csaknem teljesen megszárítjuk, majd piridingőz-légkörben (piridingőz egyensúlyban 7.0 pH-értékű mólos piridinaiCetát-oldattal) 18 óra hosszat 37 C° hőmérsékleten felfüggesztve tartjuk. Ezután a papírlapot 1 óra hosszat légáramban tartjuk felfüggesztve, majd az eredeti oldattal, az enzimmel inkübáltatott oldattal és C-cephalosporin oldattal jelezzük, azután pedig elektroforézisnek vetjük alá 0,05 mólos piridinaeetát oldatban, 4,5 pH-'értéken, 3 óra hosszat, 14 V/cm potenciálkülönbséggel. Az elektroforézisnek alávetett papírlapot ezután 1 óra hosszat légáramban tartjuk felfüggesztve, majd bioautográfiai módszerrel vizsgáljuk Staphylococcus aureus mikroorganizmussal beoltott ágár-lemezeken. A kapott eredményeket az alábbi táblázatban foglaltuk össze. A katód irányában történő vándorlási távolságokat negatív jellel adtuk meg, míg az anód irányába történő vándorlást pozitív jellel: Vándorlási Minta: távolság, cm: G-cephalosporin* +6,6 G-cephalosporin, pír dinnel kezelve —1,4 G-cephalosporin enzimmel kezelve 4 7,4 G-cephalosporin enzimmel, majd piridinnel kezelve 47.1 C-cephalosporin 4 6,6 C-oephalosporin piridinnel kezelve —1,3 * a ,,G-cephalospórin" a 7-fenilacetamido-cephalosporánsavat jelenti. 4