151339. lajstromszámú szabadalom • Eljárás specifikus antigéneket tartalmazó diagnosztikai reagensek előállítására Tbc-kórjelzés céljaira

151339 3 4 Ugy találtuk, hogy e kétféle ellenanyagnak a baktériumok elleni védőhatása is merőben különböző; míg a citoplazma-ellenanyag jól immunizál a tbc. baktériumok elleni fertőzéssel szemben, addig a burok-ellenanyag nem nyújt védelmet a fertőzés ellen. E felismerésünk gyakorlati hasznosítása azonban egy külön találmányunk tárgyát képezi. Az említett kétféle ellenanyag általában nem egyidejű képződésének felismerése tette lehetővé a tbc. komplementkötési módszerrel történő kórjelzése terén eddig fennálló bizonj7

talanságok kiküszöbölését is. A jelen találmány értelmében ugyanis elkülönítve állítjuk elő a két különböző ellenanyag képződését kiváltó kétféle antigént, amelyekkel azután külön-külön végezzük el a komplementkötési reakciót; az így szigorúan specifikus antigénekkel párhuzamosan végzett diagnosztikai reakciók nemcsak teljesen megbízható kórjelzést tesznek lehetővé, hanem a kapott két eredmény egybevetése pl. embernél a betegségnek az adott időpontbeli állapotára vonatkozólag is bizonyos következtetéseket enged meg. A találmány tehát oly eljárás specifikus antigéneket tartalmazó tbc. diagnosztikai reagensek előállítására, amelynek értelmében külön burokantigén és külön test-antigén reagenst készítünk oly módon, hogy egyrészt elölt és (pl. leszívatással) víztelenített tbc. baktériumtömeget propilalkohollal forralva kivonatolunk, a baktériumok lipoid-burkának így kapott propilalkoholos oldatát vízzel meghatározott arányban hígítjuk és ezt a vizes oldatot használjuk fel burok-antigén törzsoldatként, másrészt élő tbc. baktériumok lipoil-burkát propilalkohollal, a baktériumokat el nem pusztító körülmények között leoldjuk és az így buroktalanított baktériumok beszárított porából fiziológiai konyhasóoldattal való eldörzsölés útján készítjük a citoplazma-ántigén reagenst. Az így kapott, megfelelő koncentrációra beállított kétféle antigénoldattal azután külön-külön végezzük el és értékeljük ki a komplementkötési reakciót tbc. kór jelzésére. A találmány szerinti eljárás gyakorlati kivitele a következő módon történhet: Autoklávban 115 C° hőmérsékleten elölt, majd desztillált vízzel többször átmosott bovintípusú baktérium-tömeget Büchner-tölcsérre kiterített szűrőpapíron Pfeif fer-szivattyűval alaposan víztelenítünk. A víztelenített baktériumtömeg hűtőszekrényben jól eltartható. Ebből a baktériumtömegből 0,7—0,8 g anyagot kémcsőben egyenletesen eloszlatunk 10 ml propilalkohoiban és ezt vízfürdőn 1 perc alatt forrásig melegítjük, majd 1 percig forraljuk. Leülepedés után a forró propüalkoholos kivonatot leszűrjük és még forrón felhígítjuk 1 : 40 tf. arányban, ugyancsak kb. 90 C°-ra felmelegített desztillált vízzel; az így kapott vizes oldatot használjuk fel burok-antigén törzsoldatként a komplementkötési próbához. A leírt módon nyert burok-antigén törzsoldat anti-komplementér határértéke 1 :180 és 1 : 240 között ingadozik. A reakciók teljesen megbízható kiértékelésié érdekében kívánatos a törzsoldat antigén-koncentrációját titrálással meghatározni. E célból 5—5 ml törzsoldatot 0,25, 0,5, 0,75 ill. 1,0 ml desztillált vízzel hígítunk és ezekből a fokozatos alaphígításokból egy-egy szokásos (pl, 320-, 480-, 640- és 960-szoros) hígítás-sorozatot készítve, ezekkel komplementkötési próbákat végzünk ismert klinikai állapotú egyedek inaktivált vérsavójával. Így egyszerű módon megállapíthatjuk azt az alaphígítást, amellyel a komplementkötési próba teljesen megbízható eredményt ad. A citoplazma-antigént virulens baktériumtörzsekből állítjuk elő, a burokanyag propüalkoholos leoldása útján. Virulens törzsként pl. H—37 jelzésű humán törzset vagy „Ravenel" jelzésű nemzetközi bovin-törzset alkalmazunk és ezt Souton-féle táptalajon, Roux-palackokban 4—6 hétig tenyésztjük. A baktériumok által a táptalajon képezett összefüggő hártyát kiizzított kaccsal kiemeljük és propilalkoholt tartalmazó steril edénybe visszük át, ahol a baktériumok széthullanak és leülepednek. Az edényt 3 napig 37 C° hőmérsékleten tartjuk, közben többször felrázzuk, a harmadik napon az üledék feletti propilalkoholt dekantáljuk és friss propilalkohollal pótoljuk. E műveletet kétnaponként, összesen négyszer megismételjük, majd — a tökéletes zsíroldás biztosítás és a baktériumtestek önagglutinációjának elkerülése érdekében —• toluollal még két ízben hasonló módon kezeljük az üledéket. Végül a toluolt is dekantáljuk és a visszamaradt citoplazma-üledéket 37 C° hőmérsékleten teljesen beszárítjuk. A humán-típusú bacilusok ennek során hófehér, a bovín-típusúak pedig sárgás árnyalatú, törékeny, gipsz-szerű lemez alakjában száradnak be. Az így kapott száraz készítményt poritjuk; ez a steril baktériumpor hűtőszekrényben huzamos ideig tárolható, használhatóságának csökkenése nélkül. A komplernentkötési próba céljaira szolgáló citoplazma-antigént ebből a száraz baktériumporból készítjük el. Célszerű használatbavétel előtt minden egyes készítményt ártalmatlanság szempontjából ellenőrizni; ez úgy történik, hogy tengerimalacokat intramuszkulárisan beoltunk 0,2 ml antigénnel és 6 hét múlva megvizsgáljuk a beoltott állatokat. A szerodiagnosztikai reagens elkészítése céljából egy normál kacsnyi baktériumport steril körülmények között eldörzsölünk fiziológiás konyhasóoldattal, majd az így kapott szuszpenziót fiziológiás konyhasóoldattal 10 ml térfogatra töltjük fel, azután pedig ülepedni hagyjuk. A szupernatans folyadékot leöntjük és az üledéket turbidimetriás módszerrel a kívánt sűrűségre állítjuk be. Így kapjuk a komplementkötési próbához felhasználandó alaphígítást, amelyet azután a diagnosztikai próbához még kétszeres, négyszeres, hatszoros, ill. nyolcszoros térfogatra hígítunk. 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2