150875. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 5'-mononukleotidek előállítására
150.875 3 5. példa: Csipkebogyót homogenizátorban 5 percig aprítunk és ezt követően tizenötszörös mennyiségű kollidin-pufí'eroldattal (pH 7.5) elegyítjük és kevés kloroformot adunk hozzá. Keverés közben 8 óra hosszat extraháljuk, majd centrifugáljuk. G. példa: Földimogyoró (Arachis hypogaca) hornogenizátorban három percig aprított daráját tizenötszörös mennyiségű 7,5 pli-jú kollidin pufíeroldattal felvesszük, és toluol hozzáadása közben 3 óra hosszat szobahőmérsékleten keverjük. A fel nem oldódott rész leválasztása után az extraktumot nukleinsav hasítására használjuk fel. 7. példa: Búzaolajcsírát (Tritium vulgare) szárazon homogenizätorban felaprítunk, a port tízszeres menynyiségű 7,5 pH-jú trisz-pufíeroldattal elegyítjük és toluol hozzáadása közben 2 óra hosszat szobahőmérsékleten keverjük. Centrifugálás után a felső oldal fázist nukleinsav hasításra használjuk fel. 8. példa: Nukleinsavak 5'-rnonormkiootidokká való hasítása esetében kiváló eredményeket sikerül elérnünk, ha a • búzaolajcsíra extraktumot további tisztításnak vetjük alá. Az alább ismertetett tisztító művelet utolsó szakaszában az o'-íoszfor --dieszteráz tiszta alakban nyerhető. A péida közelebbről megvilágítja a követett eljárást: 200 g búzaolajcsírát előzetes homogenizáforban történő felaprítás után fc.itszrros mennyiségű 7,5 pH-jú trisz-pufíeroldattal két óra hosszat keverünk (toluol 'hozzáadása kőiben), majd centrifugáljuk. A felül elhelyezkedő fázist 1,5 g kalciumfoszfát-géllel elegyítjük, keverjük és centri-A hasítás lefutásának meghatározása céljából az egyes mintákat átgőzöles és előzetes lehűtés fugáljuk. Ezután a felső fázishoz az előbb emiitett gélből 18,0 g-t adunk hozzá, keverjük és centrifugáljuk. Végül a felső fázishoz további 10 g gélt adunk hozzá. Keverés és centrifugálás után az üledéket 0,2 értékre telített ammóniumszuiíátoldattal 0 C°-on eluáljuk ás a gélt lecentrifugáljuk. A felül elhelyezkedő folyadékfázist amrr.óniumszulfát oldattal 0,55 telítettségi értékre állítjuk be, keverjük ás centrifugáljuk. A csapadék elválasztása után az oldathoz annyi aramóniumszulfátot adagolunk, hogy 0,75 telítettségi értéket érjünk el. Az így képződő csapadékot kevés 7,5 pH-értékű trisz-pufferoldattal felveszszük. Az oldat az 5'-foszfordieszteráz-enzimet tartalmazza. 9. példa: 20 g tisztított árpacsírát 3 óra hosszat 20 ml 8,5 pH-értékű trisz-pufferoldattal extrahálunk, majd 30 percig körülbelül percenként 10 O'OO— 15 000 fordulatszámú centrifugán centrifugáljuk. Az oldatot egy éjszakán át csapvízzel dializáljuk, majd dextránbázisú, dietilaminoetil - csoportokat tartalmazó ioncserélőre („Sephadex DEAE, a 50 típus, coarse" a Pharmacia cég, Uppsala, Svédország gyártmánya) visszük, amelyért előzőleg 1/100 mol, ti'isz-pufferrel kezeltünk. Az enzimet )5 v i e\u ee^KiJ"puli j uel eluáljuk konyha^o,urit ^ Jk dmT igával Az °luilt enzim, a ka n )* i 1 i old bT ug aktivitású 1 L i^ * Min" (^-7 s -i nO eif"gatics7 vagyis 1 v i^ 10 i 'o£.alresz 1 •) pel da szenni elő T 4 ikt mi u u ~ib < ilo« 1 tc / nukJeir"-a\j ) 5ii i letoltg 19) tcifogatrev r '' ,-uí-i i AH 0 1 m tiiví-p'dfe'boJ vagy kollidin>u^ u<' tl'< 1 «'no1 ! ti ii 1 toVg kloroformmal icacsziii L ->k«v* c ' -fm i o ' ^ - ,7-»><"H-i'f> i < e 1o ->I- J TI 1Í tr-v 'dc"(o' ° + ) , c / -/pl hel> e-1 fsitjuk V enzimaü'-ms hasítást 37 C°-on foganatosítják. Az eredményeket az alábbi I. táblázat 6 és 7 oszlopaiban tüntetjük fel. után íriklórecetsav-uranilaeetáfoidattal (Mac Fadyens-reagens) elegyítjük és szűrjük, hogy az át I. Táblázat Oszlop 1. 2 *-> 4 5 6 7 Pufferoldat pH—7,5 Nukleinsav Példa: Enzimoldat Nukleinsav-oldal (5%) Pufferoldat pH—7,5 Hasítás időtartama nukleinsav hasítás % lehasítás % 1 60 10 30 12 95,0 10,0 2 60 10 30 18 51 9,3 3 60 10 30 12 70 12,5 4 60 10 30 12 62.5 13,8 5 60 10 30 21 20,2 9,8 6 60 10 30 21 20,8 7,9 7 60 10 30 12 81 _-42,6 8 1.4 10 30 12 90 1,0 1,0 10/0,2% 19 10 100 0,0
