150866. lajstromszámú szabadalom • Eljárás egy új antibiotikum előállítására
150.866 7 dákban leírt eljárások során az antibiotikus aktivitás meghatározása diffúziós módszerrel történt, Mycobacterium sp. ATCC 607 törzset alkalmazva érzékeny mikroorganizmusként; a tiszta kristályos antibiotikum egy mintáját alkalmaztuk összehasonlításul. Ezt az antibiotikus aktivitást az összehasonlításul alkalmazott tiszta kristályos antibiotikum mcg-jában fejeztük ki a vizsgált szilárd termék 1 mg-jára ill. a vizsgált oldat 1 ml-iére vonatkoztatva. 1. példa: Egy 170 literes fermentorba az alábbi anyagokat visszük be: kukoricalekvár (50%-os száraz kivonat) 2,40 kg szacharóz 3,60 kg kalciumkarbonát 0,90 kg ammőniumszulíát 0,24 kg vízvezetéki víz, feltöltve 100 literre Az így elkészített táptalaj pH-értéke kb. 6. A táptalajt gőzbevezetés útján 40 percig sterilizáljuk 122 C° hőmérsékleten. A sterilizálás és 27 C° hőmérsékletre történő lehűtés után a táptalaj végső térfogata 120 liter, pH-értéke pedig 6,85. Ezt a táptalajt azután Streptomyces caelicus törzs rázott Erlenmeyer-lombikban tenyésztett kultúrájának 200 ml-jével beoltjuk. A fementorban levő kultúrát óránként 5 m3 steril levegővel szellőztetjük és lapátos keverővel percenként 350 fordulattal keverjük. A hőmérsékletet 26—27 C°-on tartjuk. Á közeg pH-értéke lényegileg a fermentáció egész folyamán a kezdeti értéken marad. A mikroorganizmusok fejlő"dése a 20. óra táján kezdődik meg. A beoltás után 48 órával a kultúra már alkalmas arra, hogy a termelő fermentorba kerüljön beoltásra. A termelő kultúrát egy 800 literes fermentorban szaporítjuk; a fermentorba az alábbi anyagot visszük be: szójaliszt 16 kg cefresűrítmény 2 kg kukoricakeményítő 6 kg szójaolaj 6 kg nátriumklorid 4 kg vízvezetéki víz, feltöltve 350 literre Az így kapott táptalaj pH-értékét 400 ml tömény nátronlúg hozzáadásával 7,6-ra állítjuk be. A táptalajt gőzbevezetés útján 40 percig sterilizáljuk 122 C° hőmérsékleten. A sterilizálás után a táptalajt 26—27 C° hőmésékletre hűtjük. Ebben az állapotban a táptalaj térfogata 400 liter, pH-értéke kb. 6,5. Ezután a táptalajt a 170 literes fermentorban szaporított inokulum-kultúra 40 literjével beoltjuk. A közeget lapátos keverővel percenként 205 fordulattal keverjük, óránként 15 m3 steril levegővel szellőztetjük, hőméréskletét pedig 26—27 C°-on tartjuk. A fermentációs közeg pH-értéke 24 óra alatt 6,5-ről lassan 5,95-ig csökken, majd ismét emelkedni kezd és 90 órai fermentáció után eléri a 8,35 értéket. Az antibiotikum termelése a 40. óra táján kezdődik meg. 90 óra elteltével a fermentációt megszakítjuk. A közegben jelenlevő antibiotikum mennyisége ekkor 410 mcg/ml. 2. példa: Keverővel ellátott tartályba 170 liter előző példa szerinti fermentációs terméket viszünk be (amelynek antibiotikum-tartalma 410 mcg/ml). A fermentációs levet 1 óra hosszat keverjük, miközben pH-értékét 5 n sósav hozzáadásával 5-re állítjuk be, majd 10 kg szűrési segédanyagot adunk hozzá. Az elegyet ezután szűrőprésen leszűrjük és a szűrőlepényt 70 liter vízzel utánamossuk. A kapott 205 liter szüredék pH-értékét 5 n sósav segítségével 3-ra állítjuk be, majd előbb 60 liter, azután 40 liter etilacetáttal extraháljuk. A szerves oldószeres kivonatokat egyesítjük és csökkentett nyomás alatt 1 liter térfogatra bepároljuk. A kapott koncentrátumot 10 liter hexánnal elegyítjük, a levált csapadékot elkülönítjük, mossuk és szárítjuk; az így kapott nyers termék menynyisége 86 g, antibiotikus aktivitása 488 mcg/mg. A fenti eljárás során kapott anyalúgokat alumíniumoxid-oszlopon vezetjük át, majd az oszlopot hexánnal mossuk; az oszlopon így adszorbeáltatott terméket metanollal eluáljuk. A kapott metanolos oldatot csökkentett nyomás alatt bepárolva további 9 g nyers termékhez jutunk, amelynek .antibiotikus aktivitása 415 mcg/mg. 3. példa: 50 g nyers terméket, amelyet a 2. példa szerinti eljárással kaptunk és amelynek antibiotikus aktivitása 488 mcg/mg, feloldunk 500 ml kloroformban. A kapott oldatot leszűrjük, majd egy 1 kg alumíniumoxidot tartalmazó oszlopon folyatjuk keresztül. Az oszlopon adszorbeált antibiotikumot 2,5 liter kloroformmal eluáljuk, míg a szennyezések az oszlopon adszorbeálva maradnak. A kapott kloroformos oldatot vákuumban szárazra bepároljuk. Ily módon 29,5 g tisztított terméket kapunk, amelynek antibiotikus aktivitása 781 mcg/mg. 25 g fenti tisztított terméket 1,25 liter diizopropiléterben oldunk szobahőmérsékleten, majd a kapott oldatot 5 ' g aktívszén hozzáadásával 15 percig keverjük. Ezután leszűrjük és a szüredéket szobahőmérsékleten 3 óra hosszat kristályosodni hagyjuk. A levált kristályokat elkülönítjük, mossuk és megszárítjuk; ily módon 15,8 g tiszta terméket kapunk, melynek antibiotikus aktivitása 1000 mcg/mg. 4. példa: Keverővel felszerelt tartályba 1000 liter oly fermentációs levet viszünk be, amelyet több, az 1. példában leírt módon lefolytatott fermentációs műveletből nyertünk és amelynek antibiotikus aktivitása 390 mcg/ml, pH-értéke pedig 7,8. A fermentációs lé pH-értékét sósavval 5-re állítjuk be, majd 45 kg szűrési segédanyag hozzáadásával 30 percig keverjük. Ezután a keveréket szűrőprésen leszűrjük és a szűrőlepényt 200 liter víz. zel utánamossuk. A kapott szüredéket, amelynek
