150782. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 6-aminopenicillánsav előállítására

Megjelent: 1964. március Zl. MAGYAR NÉPKÖZTÁRSASÁG •«TN5. SZABADALMI LEÍRÁS ORSZÁGOS TALÁLMÁNYI HIVATAL 150.782 SZÁM Nemzetközi osztály: C 07 c 3 GO—861 ALAPSZÁM Magyar osztály: 30 h 1-8 SZOLGALATI TALÁLMÁNYEljárás 6-aminopenicillánsav előállítására Gyógyszeripari Kutató Intézet, Budapest (60%), BIOGAL Gyógyszergyár, Debrecen (40%) Feltalálók: Szentirmai Attila biológus (40%), dr. Horváth István vegyész (15%), Dóczi Bálint vegyészmérnök (5%), (Gyógyszeripari Kutató Intézet), tír. Nyiri László biológus (20%)), Lengyel Zoltán vegyészmérnök (15%), Szabó József vegyészmérnök (5%), (Biogal Gyógyszergyár) A bejelentés napja: 1962. július 10. Ismeretes, hogy számos mikroorganizmus tartalmaz olyan enzimeket, amelyek a G- vagy V-penicillinről a fenil-, vagy fenoxi-csoportot lehasítják és így 6-aminopenicillánsav keletkezik (Robinson G. N., Batchelor F. R, Butterworth D., Cameron—Wood J., Cole M., Eustace G. O., Hart Marian V., Richards M., Chain E. B.; Nature (Lond. 187. 236 [I960]). Az átalakítást végző enzimet „penicillin amidáz"-nak nevezték el. A 6--aminopenicillánsav előállításának nagy jelentősége van, mert belőle a legkülönbözőbb új és gyógyászati szempontból hasznos tulajdonságokkal rendelkező penicillinféleségeket lehet előállítani. A különböző mikroorganizmusok közül legelterjedtebben az Esherichia coli-t használják az enzimatikus bontás elvégzésére. Ez a baktérium, megfelelő táptalajon és megfelelő körülmények között tenyésztve, a sejthez kötve tartalmazza az amidáz enzimet. Az enzimet általában nem állítják elő tisztán, hanem a centrifugált és mosott baktériumsejteket használják fel a bontásra. A penicillin bontásához a sejteket; iparilag alkalmazott méretű fermentorokban kell tenyészteni, a sejtek elválasztása a tenyésztés után szűréssel nem végezhető (E. coli csak baktérium szűrőn szűrhető!), csak nagyteljesítményű centrifugák folyamatos üzemeltetésével vihető végbe. A kapott sejttömeget a penicillin oldatában szuszpendálják. A sejttömegben jelenlevő enzim a penicillint 6-aminopenicillánsavvá alakítja. Fokozott műszaki nehézséget jelent és veszélyezteti a bontás üzembiztos keresztülvitelét, az a tény, hogy e bontás után a sejtek centrifugálással való eltávolítása rendkívül nehéz. Ugyanis a bontás alatt a sejtek egy része autolizál, a bontó enzim egy része és sok más fehérje szabaddá válik, mely gátolja a sejtek ülepítését és nehezíti a 6-aminopenicillánsav kinyerését. Az autolízis hatása ezenkívül rendkívül káros azért, mert az általa oldatba került enzim a centrifugáláskor oldatban marad és elvész, s így a visszanyert sejtek csak az enzim 60—70%-át tartalmazzák. Ennek folytán a sejttömeg többszöri felhasználása esetén nemkívánatos veszteségek adódnak. Vizsgálataink során arra a meglepő felismerésre jutottunk, hogy a bontásra alkalmas sejteket adszorbeálni lehet gélszerű anyagokon és az adszorbeált sejtek enzimaktivitása nem csökken. Ezen adszorpció céljára különböző gélszerű anyagokat próbáltunk ki, többek között alumíniumhidroxidot és kálciumfoszfátot. Legalkalmasabbnak a kálciumfoszfát gél mutatkozott. (Kalciumfoszfát gélt Theorell és Akeson módszerével állítottuk elő. [Theorell H., Akeson A. in „Biochemical preparations" Vol. 6. p. 57. Edit. C. S. Vestling. John Wiley et Sons Inc., New York, 1958].) Ha a baktériumtenyészethez hozzákeverjük a káliiumfoszfát gélt, a gélen megkötött baktériumokegyszerű szűréssel, vagy alacsony fordulatszámú centrifugálással könnyen eltávolíthatók a íermentléből. A bontás elvégzése után a kálciumfoszfát gélhez kötött enzimaktivitás ugyancsak szűréssel, vagy centrifugálással jól visszanyerhető, mert az autolízis révén szabaddá váló enzim is nagyrészt megkötődik a gél felületén. A gél az autolízis