150690. lajstromszámú szabadalom • Eljárás különösen infúziós célokra szolgáló fruktóz előállítására mikrobiológiailag szintetizált leván hidrolízise útján
2 150.690 olyan fiziológiai viszonyokat teremt, amelyek a mikroorganizmusok növekedésére károsak. A [er • mentációs idő 5 napról mintegy 10 napra növekszik, azonkívül az alapanyag egy része, mintegy 2'0%-a, nem használható fel, minthogy a növekedés nagyon erősen gátolt. Az irodalomból ismeretes, hogy a levánkinyerés növelése azáltal érhető el, hogy a szintézistenyészethez a fermentáció kezdetekor kis mennyiségű levánt adagolnak. Noha az úg3'nevezett starter (indító) leván hozzáadása megnöveli a hozamot, a nagy 3'0%-nál nagyobb) cukorkoncentráció miatt a szintézisidő itt is 10 napra emelkedett. Az ábrán a Pseudomonas spec, törzstenyészet, 15%-os szaccharóz közegben való fermentációja során végbemenő folyamatokat tüntetjük fel. A diagram abszcisszáján a tenyészidőt (i) órában, az ordinátán pedig a biológiai anyag ás leván rng/ml mennyiségeit (c) ill. a pH-értékeket ábrázoljuk. Az 1 görbe leván, a 2 görbe a biológiai anyag mennyiségének tenyészközegben való változását, míg a 3 görbe a tenyészközeg pH-érték változását tünteti fel. Az ábrából kitűnik, hogy a levánképzés maximuma a baktériumgyarapodás maximumától időben jelentősen el van tolva. A levánképzés maximuma csak akkor észlelhető, amikor a mikroorganizmusok a logaritmikus növekedési fázis fiziológiai állapotát elhagyják. A találmányi gondolat lényeges része, hogy a fázist egymástól elválasztjuk, éspedig úgy, hogy az első lépcsőben a szaporodást az indító leván egyidejű képzése közben optimális feltételek mellett vezetjük, a második lépcsőben pedig a tulajdonképpeni szintézis megnövelt cukoradagolás mellett megy végbe anélkül, hogy az a baktériumok növekedésére észrevehetően káros lenne. A kétlépcsős eljárás alkalmazása által tehát az első lépcsőben állítjuk elő a baktériummasszát, a fermentáló legnagyobb részét és az indító levánt, a második lépcsőben pedig a megfelelő mennyiségű szaccharóz hozzáadása által a leván térfogathozamát 5%-nál nagyobbra növelhetjük. A találmány szerint az erjesztés lefolyása mind az első, mind a második lépcsőben akár szakaszosan, akár folyamatosan végbemehet. A kétlépcsős eljárással előállított levánoldat a nagy térfogathozam következtében erősen viszkózus, a pH-érték 4—4,5, az elhasználatlan szaccharóz mennyisége 5% alatt van. A feldolgozás közvetlenül az erjesztőkádban, vagy valamely elkülönített edényben (ún. ülepítőtartályban) történhetik. Az utóbbi lehetővé tételére a levánoldatot annyi alkohollal, pl. metanollal elegyítjük, hogy leván még nem válik ki, az oldat viszkozitása viszont csökken, így egyszerűen az ülepítőtartályba vezethető. A tisztítás fő feladata abban áll, hogy a levánt a tenyészoldat alkatrészeitől, beleértve a szabaddá tett glukózt is, mentesítsük. A tisztítás szénhidrátok esetében teljesen, sók és fehérjék esetében pedig nagyrészt lecsapás által érhető el. A kétszeres lecsapás a legnagyobb követelményeket is kielégíti, pl. ily módon infúziós oldatokat is előállíthatunk. A leván teljes leválasztása végett, az oldatot metanol oldószer esetében a kétszerestől a négyszeres mennyiségű metanollol hígítjuk. Alkalmazhatunk szűrőrétegen át történő szűrést és/vagy adszorpciós szerekkel, mint pl. kovafölddel és szénnel való kezelést, amely azonban a leválasztás által elért tisztító hatást nem javítja lényegesen és az adszorbensen, illetve a szűrőrétegen visszamaradó levánveszteségekhez vezethet. A leválasztás után a levánt annyi desztillált vízzel hígítjuk, hogy mintegy 5%-os oldat keletkezzék. A nyert oldatot felmelegítjük és valamilyen savval, pl. sósavval, vagy hidrogéniontartalmú anyagokkal, pl. savanyú sókkal vag3' kationkicserélőkkel elegyítjük és hidrolizáljuk. A hidrolízis hőmérséklete éppen úgy, mint a hidrogénionkoncentráció tág határok között változtatható, de ezeket a változásokat infúziós oldatok előállításánál úgy kell megválasztani, hogy mind a hőmérésklet, mind a hidrogénionkoncentráció és az időszükséglet kicsi legyen, infúziós célokra használt fruktózoldatoknál az optimális pH-érték 2, a hőmérséklet < 90 C° és a hidrolízis ideje <; 5 perc, minthogy ily módon a nemkívánatos bámulások, valamint a vízszegényebb fruktózvegyületekké való átalakítás (difruktózdianhidrid) elkerülhetők. Kationcserélő alkal- < rnazása esetén a hidrolízis mind szakaszosan edényben, mind folyamatosan oszlopon megvalósítható. Magától értetődő, hogy a három nevezett változó, a pH, a hőmérséklet és az idő, messzemenően variálhatók és hogy mind a leván molekula súlya, mind a felhasználási cél és a tisztasági fok befolyással vannak. Az is lehetséges, hogy a hidrolízist csak tökéletlenül visszük végbe úgy, hogy alacsonymolekulájú levánt, vagy a levánsor oligoszaccharidjait nyerjük. Az infúziós célokra való fruktóz kinyerése végett a fennmaradó sókat és fehérjeanyagokat is el kell távolítani. A fehérjék eltávolítására ismert módszereket, mint pl. adszorpciót és szűrést alkalmazhatunk. A fruktózzá hidrblizált leván esetében a fehérjeanyagok az oldatnak pl. 10°-ra való lűlhűtése által koagulálhatók, majd szűréssel könynyen eltávolíthatók. A sók eltávolítása ioncserélők segítségével történik. Olyan infúziós oldatok előállítására, amelyeket általában 10—20%-o-s fruktózoldatokként alkalmazunk, az oldatot szűrés és ioncserélés után vákuumban való bepárlás által hozzuk a megfelelő koncentrációra. A találmány mind a magas térfogathozam elérése, mind az egyszerű és eredményes tisztítási lehetőség miatt lehetővé teszi oly fruktózpreparátumok előállítását, amelyek tisztasági foka nagy követelményeket is kielégít. Már a leván egyszeri leválasztása és az ezt követő hidrolízis által kristályosítható fruktózt nyerünk. Kétszeri leválasztás után a fruktóz annyira tiszta, hogy az infúziós oldatként való alkalmazáson kívül minden más terápiai alkalmazásra megfelel. A fruktőzon kívül más cukor kromatográfiailag nem mutatható ki. A lecsapatást követő tisztítási eljárásoknak csupán az a céljuk, hogy a só- és fehérjetartalom tekintetében az infúziós oldatokra érvényes szabvány előírást kielégítsék. (N 1 mg/100 ml.) 1. példa: Valamilyen 5 napos törzstenyészetből (Pseudomonas sp.) egységnyi nyálkát oltunk át a következő összetételű oltóoldat 1O0 ml-ébe:
