150632. lajstromszámú szabadalom • Eljárás egy új antibiotikum előállítására
8 150.632 A fentebb leírt módszerek természetesem egymással kombináltan, különböző sorrendben., vagy az egyes műveletek többszöri megismétlésével is alkalmazhatók, a mindenkori gyártási szükségleteknek megfelelően, hogy a kívánt felhasználási célnak megfelelő alakban, célszerű módon nyerhessük ki a 9671 ~R. P. antibiotikumot. A találmány szeriinti eljárás gyakorlati kiviteli módjait közelebbről az alábbi példák szemléltetik; megjegyzendő azonban, hogy a találmány köre egyáltalán nincs ezekre a példákra korlátozva. Az alábbi példákban leírt műveletek során a termékek amtibiotikus aktivitását turbidimetriás módszerrel határoztuk meg; mikroorganizmusként Staphylococcus, aureus 209 P törzset alkalmaztunk e meghatározásokhoz az eredményeket a tiszta kristályos antibiotikum mintájához viszonyítva. Az aktivitásit a kristályos termék mcgjában fejeztük ki, a vizsgált termék 1 mg-jára vonatkoztatva, oldatok esetében pedig a tiszta kristályos minta mcg-jában az oldat 1 cm3 menynyiségére vonatkoztatva. 1. példa: Egy 75 literes fermentorba az alábbi anyagokat adagoljuk be: kukoricalekvár (50%-os száraz kivonattartalommal) 800 g szaccharóz 1200 g ammóniumszulf'át 80 g víz (vízvezetéki) 35 liter Az elegy pH-értékét 20 ml nátronlúg (fs. 1,33) hozzáadásával 5,2 körülire állítjuk be, majd még hozzáadjuk az alábbi anyagot kalciumkarbonát 300 g Az így elkészített tápközeget 40 percig sterilizáljuk 122 C° hőmérsékleten, gőzbevezetés útján. A sterilizálás után a közeget 27 C° hőmérsékletre hűtjük le; a végleges térfogat 40 liter, a pH-érték pedig 7,15, Ezután a itápközeget beoltjuk a Streptomyces 40037 törzs rázott Erlenmeyer-lombikban A f érmem torban. a kultúrát steril levegővel szellőzteti ük; a levegőt óránként 3 m3 sebességgel vezetjük be, a kultúrát állandóan keverjük, percenként 400 fordulatszámú csavarszárnyas keverővel. A hőméréskletet 27 C-on tartjuk. A közeg pH-értéke 4 órán át megmarad az eredeti szinten (7,15), majd lassan csökken 6,85-ig. A gomba fejlődése párhuzamosan halad a pH-érték e csökkenésével; 28 órával a beoltás után ez a kultúra már alkalmas a termelő fermentorba történő beoltásra. A termelő fermentációt egy 350 literes fermentorban folytatjuk le, amelybe az alábbi anyagokat adagoljuk be: szójaliszt szeszicefre-sűrítimény glükóz szójaolaj kalciumkarboniát nátrium klorid 1 kg 1 kg 4 liter 2 kg 2 kg , 175 liter A közeg pH-értéke sterilizálás előtt 6,95. A közeget 40 percig sterilizáljuk 122 C° hőmérsékleten, közvetlen gőzbevezetés útján. Sterilizálás és 27 C°-ra történő lehűlés után a tápközeg végleges térfogata 200 liter, pH-értéke 7,20. Ezután a tápközeget beoltjuk a. fentebb említett 75 literes fermentorban nyert kultúra 20 literjével. Az élegyet turbinás keverővel percenként 205 fordulatszámmal keverjük és óránként 10 m3 steril levegővei szellőztetjük, miközben a hőmérsékletet állandóan 27 C°-on tartjuk. A közeg pH-értéke 24 órán át lassan csökken, majd ismét emelkedik. A pH-értékmek ez az elmélkedése jelzi az antibiotikumHtermelés megkezdődését. A fermentáció végpontját a pH-érték görbéje nem jelzi; kb. 90 óra elteltével fejezhető be a fermentáció. A közeg aktivitása ekkor 295 meg/ml. 2. példa: 190 liter fermentációs levet (az 1. példa szerinti 295 mcg/ml aktivitás tartalommal) beviszünk egy keverővel felteereit tartányba. A fermentációs levet 1 óra hosszat keverjük 110 liter butanollal, miközben a pH-értéket híg sósavval 5-re állítjuk be; ezután 19 kg szűrési segédanyagot adunk hozzá. Az elegyet sízűrőprésen leszűrjük. és a szűrőlepényt 50 liter vízzel mossuk. A szerves fázist különválasztjuk, majd 11 liter 9 pH-értékre beállított vízzel, azután pedig 11 liter 5 pH-értékre beállított vízzel mossuk. A szerves réteget ismét különválasztjuk, majd csökkentett nyomás alatt az eredeti fermentációs lé térfogatának 1/100 részére, azaz 1,9 liter térfogatra bepároljuk. 24 órai hűtés után a kapott csapadékot elkülönítjük, mossuk és megszárítjuk. Ily módon 88 g nyers terméket kapunk, amelynek aktivitása 434 mcg/mg. 3. példa: 70 g 2. példa szerint kapott 434 mcg/mg aktivitású terméket 1400 ml metanolban szuszpendálunk és a szuszpenziót 1 óra hosszat keverjük 30 C° hőmérsékleten. Az oldhatatlanul maradt részt elkülönítjük és megszárítjuk. Ily módon 29 g terméket kapunk, amelynek aktivitása 825 mcg/mg. Ezt a terméket 750 ml 90 : 10 tf. arányú kloroform-metanol elegyben oldjuk. Az oldatot leszűrjük, majd 600 g alumíniumoxidot tartalmazó, 61 cm magas, 3,5 átmérőjű oszlopon kromatografáljuk. A kapott kromatogramot 1500 ml fenti arányú kloroform-metanol eleggyel eluáljuk. A hatóanyagban gazdag frakciókat egyesítjük, csökkentett nyomás alatt 40 ml térfogatra bepároljuk és 400 ml hexán hozzáadása útján lecsapjuk a hatóanyagot. A csapadékot elkülönítjük, mossuk és megszárítjuk. 23 g terméket kapunk, amelynek aktivitása 950 mcg/mg. Ez utóbbi, 950 mcg/mg aktivitású termék 10 gját 200 ml jégecetben szuszpendárjuk és 5 percig 50 C° hőmérsékleten tartjuk. A kapott oldatot leszűrjük, 2,5 ml vizet adunk hozzá és lassan lehűtjük. A levált kristályos terméket elkülönítjük, mossuk és megszárítjuk. Ily módon 8 g tiszta terméket kapunk, amelynek aktivitása 1000 mcg/mg. 4. példa: 170 liter 166 mcg/ml aktivitású fermentációs levet beviszünk egy keveerőyel felszerelt tartálybal Ä pH-értéket híg kénsavval 5-re állítjuk be.
