150600. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hirudin kinyerésére
2 150.600 zegben a hirudin-fehérje izoelektromos pontja alatti pH-értéken olyan szerves savak, illetve helyettesített szerves savak jelenlétében végezzük, amelyek a véralvadást gátló vegyület oldatba juttatása mellett s azzal egyidejűleg a kísérő fehérje jellegű szennyezőanyagok nagy részének a kivonatba történő bejutását megakadályozzák: az így nyert kivonatokból a hirudin a szerves oldószer koncentrációjának növelésével kicsapható, a csapadékból szelektíven kioldható és gyakorlatilag sómentes állapotban megszárítható. A találmány alapja tehát az a felismerés, hogy a hirudinfehérje oldékonysága bizonyos fehérje denaturáló szert vagy szereket tartalmazó, vízzel keveredő szerves oldószer-víz elegyekben lényegesen különbözik a kísérő fehérje, vagy fehérjeszerű anyagok túlnyomó nagy többségének oldékonyságától és így azoktól — a korábbi eljárásokkal szemben — közvetlenül elkülöníthető. A találmánv szerinti eljárás előnye valamennyi korábbi eljárással szemben az, hogy feleslegessé teszi a nyersanyag előzetes szerves oldószeres víztelenítését, nem különben a hirudinban leggazdagabb feji rész mechanikus elkülönítését, ami ipari méretekben nemcsak rendkívül munkaigényes, hanem egyúttal igen időtrabló, költséges művelet is; további jelentős előnye ezenkívül az is, hogy az eddig ismert módszereknél lényegesen nagyobb tisztaságú, gyógyászati felhasználásra alkalmas nyerstermék előállítását igen jó hozammal, gazdaságosan teszi lehetővé. A találmány szerinti eljárás értelmében a hirudinnak piócából történő kinyerésekor úgy járunk el, hogy a hirudintartalmú nyersanyagot vízzel elegyedő, nagy szerves oldószer töménységű víz szerves oldószer eleggyel, amely célszerűen 60—85 térfogat % alacsony szénatomszámú alkoholt, vagy acetont tartalmaz, szobahőmérsékleten, arra alkalmas őrlőmalomban megőröljük, majd olyan szerves sav, illetve savszármazék, illetve ezek keverékének jelenlétében, amelyek fehérje denaturáló szerként ismeretesek, előnyösn szulfoszalicilsav, vagy triklórecetsav 10—30 g/1 mennyiségének és 10—20 g nátriumklorid/1 hozzáadása után 0—50 C° közti hőmérsékleten állandó mechanikus kevertetés közben 60—180 percen át kivonatoljuk. A sötétbarna színű, kivonatot az oldatlan maradék eltávolítása után —5, —10 C° közti hőmérsékletre hűtjük, majd ugyanilyen hőmérsékletű szerves oldószer hozzáadásával a hirudint az oldatból kicsapjuk és elkülönítjük. Az alvadást gátló fehérje kioldását a csapadékból szobahőmérsékleten úgy végezzük, hogy az erősen savanyú csapadékot desztillált vízzel felszuszpendáljuk, majd állandó keverés közben pH-ját megfelelő puffersóoldat hozzáadásával 4,9—5,5 értékek közé állítjuk be; az oldatlan maradék elkülönítése után a hirudintartalmú fölöttes oldatot fagyasztott állapotból szárítjuk. Az így nyert termék hirudintartalma elektroforézis vizsgálatok alapján legalább 80%, ami jól megközelíti a kristályos fehérjék átlagos tisztasági fokát s lényegesen felülmúlja a Markvzardt-féle nyers hirudinét, amely nagy mennyiségű hatástalan fehérjeszerű kisérőanyagot tartalmaz annak ellenére, hogy a pióca izolált feji részéből nyerik. Eljárásunk kivitelezését az alábbi példák szemléltetik: 1. példa: 100 db piócát 500 ml 65 térfogat % acetont tartalmazó aceton-víz elegy hozzáadása után késes rendszerű őrlőgépben megőrölünk, majd az őrleményhez, amelyet visszafolyós hűtővel és keverővei ellátott lombikba helyezünk, 1O0 ml-ként 2 g triklórecetsavat és 1 g nátriumkloridot mérünk. A hirudin kivonását 40 C° hőmérsékleten — állandó keverés közben — 60 percen át végezzük. A kivonás befejezése után az oldatlan maradékot centrifugálással elkülönítjük, a hirudintartalmú fölöttes levet —<5, —10 C° közti hőmérsékletre hűtjük s belőle a hirudint ugyanilyen hőmérsékletű ötszörös térfogatú acetonnal kicsapjuk. Az ülepedett csapadékot centrifugálással elkülönítjük, majd szobahőmérsékleten 10—20 ml desztillált vízben felszuszpendáljuk. A savanyú vegyhatásu szuszpenzió pH-ját ezután nátriumacetát-puffer hozzáadásával 5,2-re állítjuk be állandó keverés közben; az oldatlan maradék elkülönítése után a hirudint a fölöttes oldatból fagyasztott állapotban megszárítjuk. Hozam: 180 mg, desztillált vízben kitűnően oldódó, 150 antithrombin egység/mg hatóértékű liofil por. 2. példa: 1000 db piócát 7 1 80 térfogat% etilalkoholt tartalmazó etilalkohol-víz elegyben megfelelő őrlőgépben finomra felaprítunk, majd a megőrölt hirudintartalmú anyaghoz literenként 15 g nát riumkloridot és 30 g szulfoszalicilsavat adunk. Az extrakciót visszafolyós hűtővel ellátott üveg-vagy saválló fémből készült berendezésben 10 C° hőmérsékleten 2 órán át állandó keverés közben végezzük. A kivonatot az oldatlan maradéktól centrifugálással különítjük el, ezután —5 C° hőmérsékletre hűtjük s belőle a hirudin-fehérjét ugyanerre a hőmérsékletre hűtött kilencszeres térfogatú acetonnal kicsapjuk. A hirudinnak a csapadékból történő kioldását, az oldatlan maradéktól való elkülönítését és fagyasztott állapotból való szárítását úgy végezzük, mint az 1. példában. Hozam: 1,56 g deszt. vízben is kitűnően oldódó 200 antitrombin egység/mg hatóértékű liofil por. 3. példa: 1000 db piócát 6 1 térfogat% acetont tartalmazó aceton-víz elegyben késes rendszerű őrlőgépben finomra felaprítunk, majd az őrleményhez literenként 20—20 g mono- és triklórecetsavat, továbbá 15 g nátriumkloridot adunk. A kivonást állandó keverés közben 0 C° hőmérsékleten 1 órán át végezzük megfelelő üveg- vagy saválló fémből készült, illetve zománcozott berendezésben. A kivonatnak az oldatlan maradéktól való elkülönítését, hűtését úgy végezzük, mint a 2. példában, a hirudin-fehérje kicsapását pedig hatszoros térfogatú acetonnal. A kiülepedett és elkülönített csapadékból a hirudint citromsav-dinátriumhidrofoszfát-puffer jelenlétében pH 5-ön oldjuk ki. A fagyasztott állapotból szárított liofil termék súlya 1,4 g, hatóértéke 300 antitrombin egység/mg.
