150245. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hidrokortizon vagy prednizolon előállítására

4 150.245 65%-os termeléseket mértünk és a hidrokortizonon kívül kevés átalakulatlan Reichstein-féle S-vegyület és 3, a hidrokortizonnál polárosabb anyag, melyek közül az egyik epi—F vegyületnek bizonyult, volt észlelhető gyenge folt alakjában. A papírkromatográfia etilalkohollal mosott Macherey—Nagel 214-es jelű papíron történt; stabil fázis 30%-os etilénglikol oldat volt metilalkoholban, a mobil fázis széntetraklorid és diklóretán 1 : 1 arányú elegye volt. A futtatási idő 4 óra volt 50 om-es papíron leszálló kroniatogram alakjában. Futtatás után a papírokat 3 óra hosszat 70 C°-on szárítottuk, ezután a szteroidfoltok helyét 253 m/t-nál emittáló ultraibolya lámpa segítségével kontakt fotós eljárással állapítottuk meg, a foltoknak megfelelő papírrészt kivágtuk, 10 ml etilalkohollal (pro anal) 1 órán át 37 C°-on eluáltuk, az eluátum abszorpcióját 242 rmi-nál Unicam spektrofotométerben mértük és standard görbéről kiszámítottuk a leolvasott extinkció értéknek megfelelő szteroidtartalmat. 3. példa: Roux-palackban nőtt kétnapos burgonyás agartenyészetről készített spóraszuszpenzió 50 ml-ével oltottunk be 5 liter Oi jelű táptalajt. A fermentációs körülmények azonosak voltak az 1. példában leírtakkal, 24 órás tenyésztés után a tenyészet 2 literével 60 liter GAK8

jelű táptalajt oltottunk saválló üzemi készülékben. Fermentációs körülmények: 0,2 atm. túlnyomás, kevertetés percenkénti 200-as fordulatszámmal, hőmérséklet 25 C°, levegőztetés: 0,5 térfogat levegő percenként. 48 óra múlva a tenyészetből 30 litert sterilen leengedtünk és pótlására 30 liter steril csapvizet kevertünk a tenyészethez. Az így nyert, kétszeresére hígított tenyészethez 4 óránkónt 9,6 g öszszesen 38,4 g Reichstein-féle S-vegyületet adagoltunk 960—960 ml etilalkoholban oldva. A Reichstein-féle S-vegyület koncentrációja (-y/ml-ben kifejezve) a fermentátumban a következőképpen változott: 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18. óra 143 64 19 56 23 71 30 96 69 40 A papírkromatográfiával mért hidrckortizon termelés 61,5% volt a beadagolt Reichstein-féle S-vegyületre számolva. A íermentléből a micéliumot kiszűrve a szűrletből 34 litert háromszor 6,8 liter metilénkloriddal extraháltunk. Az egyesített extraktumokat közönséges nyomáson 55 C°-on bepároltuk és a kapott metilénkloridos addukt kristályokat (14,68 g-t) 100 ml metanolban feloldva és 0,5 g aktív szénnel derítve, áukristályosítottuk. Az átkristályosítáe eredményeképpen az első generációban 10 g hidrókortizoint kaptunk, maly 216-218 C°-on bomlott (aD

= 150°, c = 1%, dioxániban). Izolálási nyeredék: 46% a bemért Reichstein-féle S-vegyületre számolva. Az anyalúg még kb. 1,5 hidrokortizont tartalmazott más polárosabb jellegű szteroidokkal keverve. Ebből még frakcionáláesal további hidrokortizon mennyiségek kinyerése lehetséges. 4. példa: A 3. példában megadott módon, de 110 liter kétszer hígított GAKs-as tenyészetben négyszer 17,6 g Reichstein-féle S-vegyületet oxidáltattunk hidrokortizonná. Az átalakítás, kvantitatív papírkromatográfiával mérve 58%-os volt. A tenyészetet nyomószűrőn sterilen leszűrtük és 60 liter szűrlethez 2 liter KAi2-es táptalajon nőtt Corynebacterium simplex tenyészetet adagoltunk. Utóbbi tenyészet elkészítése a 149 062 számú magyar szabadalmunk leírásának megfelelő módon történt. A tenyészetet ezután 18 órán át 37 C°-on, 0,2 atm. túlnyomás mellett percenként 0,5 térfogat levegő átáramoltatásával és percenként 200-as fordulatszámmal kevertetve inkubáltuk, majd kvantitatív papírkromatográfiával meghatároztuk a prednizolon tartalmát és azt 320 mg/liter értéknek találtuk. Ez a beadagolt Reichsteiin-féle S-vegyületre számolva 50%-os prednizolon termelésnek felel meg. 5. példa: A 4. példában leírt módon lefolytatva a Reichstein-féle S-'vegyület oxidációját, 5 liter fermentátumból sterilen kiszűrtük az Absidáa orchidis micéliumot és ezt a micélium mennyiséget 5 liter steril vízben szuszpemdáltuk. Az így nyert micélium-szuszpenziót üvegfermentorba helyeztük és 25 C°-os vízfürdőben, percenként 300-as fordulatszámmal kevertettük és percenként 5 liter steril levegőt áramoltattunk át rajta, Ehhez a fermentátumhoz négyszer 800 mg Reichstein-féle S-vegyületet adagoltunk 80—80 ml etilakoholban. 24 órás fermentáció után kvantitatív papírkromatográfiás módszerünkkel megállapítottuk, hogy a tenyészet 64% hidrokortizont tartalmazott a beadagolt Reichstein-féle S-vegyületre számolva. Ugyanaz a micélium tehát többször is felhasználható a Reichstein-féle S-vegyület oxidatív átalakítására. Szabadalmi igénypont: Eljárás hidrokortizon vagy prednizolon előállítására Reichstein-féle S-vegyületből (17«,21-dioxi~ progeszteronból), melyre jellemző, hogy az átalakítást Absidia orchidis, az Országos Közegészségügyi Intézetben 1961. október 20-án 611 020/1. sz. alatt letétbe helyezett speciesének, ill. annak leszármazottainak, animonszulfátot, glükózt, kukoríealekvárt tartalmazó táptalajon nőtt, hígítatlan, vagy hígított tenyészetével végezzük, az átalakítandó szteroidot alacsony szénatomszámú alkoholban oldva, szakaszosan adagoljuk a tenyészethez oly módon, hogy koncentrációja maximum 20'0 mg/l érték legyen, az átalakítás megtörténte után a í'ermentlevet a micéliumtól elválasztjuk, a hidrokortizont a fermentléből ismert módon elkülö-