150244. lajstromszámú szabadalom • Eljárás delta4-3-ketoszteroidok mikrobiológiai dehidrogénezésének optimális kivitelezésére
2 150.244 pedig az előállítandó l-dehidroszieroid mennyiségét határozzuk meg úgy, hogy megfelelő koncentrációjú tioszemikarbazid klórhidráttaí 30 percen át 40 C°-on végezzük el a tioszsmikarbazon képzést és a koncentrációkat két hullámhosszon ( /.= 302 és 325 m««) történő spektrofotometriás mérésen keresztül, matematikai képlet segítségével értékeljük ki. A találmány szerinti eljárással gyorsan elvégezhető meghatározások lehetővé teszik az átalakítás követését és ezáltal optimális műszaki .és gazdasági eredménnyel történő kivitelezését magasfokú üzembiztonság és reprodukálhatóság mellett. Az eljárás foganatosítására az alábbi példákat adjuk meg: 1. példa: Az eredetileg 200 - /xg/ml zl4 -3-ketoszteroidot (pl. hidroíkortizoint, metiltesztosateront) tartalmazó fermentlé minta 10 ml-ét 20 ml kloroformánál kirázzuk. A kloroformos fázist elválasztjuk, nátriumszulfáttal víztelenítjük és 5 ml-ét vízfürdőn bepároljuk. A száraz maradékot 5 ml 96%-os etilalkoholban feloldjuk. Az oldatot 0 C°-ra hűtjük és hozzáadunk 1 ml 0 C°-ra hűtött 0,5 mólos sósavas tioszemikarbazid reagenst (4,557 g tioszemikarbazid 50 ml n sósavban oldva és vízzel 100 ml-re kiegészítve). A reakcióelegyet 30 perces időtartamra 0 C°-on termosztáljuk, majd ennek letelte után 5 ml 5 súly/tf%-os vizes Na2 HP04 oldatot adunk hozzá. Az így kapott oldat extinkcióját vak oldattal szemben, 1 cm-es rétegvastagságban spektrofotométerrel k = 302 m/x-nál megmérjük. Az extinkcióhoz tartozó z!4 -3-ketoszteroid koncentráció értékét előzetesen elkészített standard görbén leolvassuk. A standard görbe úgy készül, hogy különböző koncentráció-arányú zí4 -3-keto-, ill. zl''4-3-ketoszteroid tartalmú vizes oldatokat (szuszpenziókat) a fenti meghatározási módszer szerint kezelünk és a zj4 -3-ketoszteroid koncentrációt a megfeleliő extinkcióval szemben gráfi kusan ábrázoljuk. A meghatározással kapott zf4 -3-ketoszteroid koncentrációt a fermentációs idő függvényében grafikusan ábrázoljuk. Amikor az így kapott görbe egy minimális koncentráció érték felé aszimptotikusan közeledik, a mikrobiológiai oxidációs folyamatot leállítjuk. 2. példa: Az eredetileg 200 /xg/ml zl4 -3-k.stoszter.oidot tartalmazó fermentációs folyadék minta 10 ml-ét 20 ml kloroformmal kirázzuk. A kloroformos fázist nátriumszulfáttal víztelenítjük, majd abból 2 ml-t vízfürdőn bep ár ólunk. A száraz maradékot 2 ml 96%-os alkoholban feloldjuk. Az oldathoz 4 ml 0,5 mólos sósavas tioszemikarbazid reagenst adunk. Az így kapott reakcióelegyet 30 percen át 40 C°-on tartjuk. Ennek letelte után 20 ml í)6%-os alkoholt adunk hozzá. Az így hígított reaikcióelegy extinkcióját vakoldattal szemben 1 cm-es rétegvastagságban spektrofotométerrel A — 302 és 325 m/x hullámhosszakon megmérjük. Az extinkeiókhoz (E302 és. E325) tartozó /J4 -3-ketoszteroid (C4) és A ! » 4 -3-keitoszteroid koncentráció (CÍM) értékeket a C4 = ki E302 —k 2 E325, ül Ci'4= ks E325 —k4 E302 képlet segítségével számítjuk ki ahol ki, k2 , ka és k4 értékeit standard szteroid oldatokkal — a műveleteket a fenti módon végezve el — kísérletileg állapítjuk meg a következők szerint: fermentációs folyadék helyett 200 /tg/ml koncentrációjú standard zJ4 -3-&eto- ill. A '•4-ketoszteroid vizes oldatokat a meghatározás szerinti módon kezelünk és mindkét esetre A =302 és 325 m final az extinkciókat meghatározzuk [£4(302)1 Ei,4(302), £4(325) és Ei,4(325) és az állandókat az alábbi képletből számítjuk ki: ki == 200 k2 = 200 k3 = 200 k4 = 200 Ei,4(325) E4 ( 3 02)-Ei ^4(325) — Ei, 4(302)- £4(325) Ei,4(302) £4(302) -Ei ,4(325) — Ej, 4(302)- £4(320) £4(302) £4(302)-Ej ,4(325) — Ei,4(302)* £4(325) £4(325) E4(302)-Ei'4(325) El,4(302) ' Ed(32 5) A különböző időpontokban vett fermentációs folyadék minták C4, ill. Ci,4 értékeit meghatározva, abban az esetben, midőn a zJ4-3-ketoszteroid minimális, A '^-S-kstosziteroid pedig 'maximális koncentráció értéket vesz fel, a fermentációs oxidációs folyamatot megszakítjuk. Szabadalmi igénypontok: 1. Eljárás zi4 -3-iketosztei'oidok mikrobiológiai dehidrogénezésének optimális kivitelezésére, melyre jellemző, hogy a mikrobiológiai dehidrogénezés tartama alatt a fermenbiéből sűrű időközben vett mintából a szteroidtartalmat szerves oldószerrel kivonatoljuk a kivonatot bepároljuk, a maradékot alifás alkoholban felvesszük, tioszemikarbaziddal reagáltatjuk, a kapott reakcióelegy extinkcióját megmérve, a z14 -3-ketoszteroid koncentrációját vagy a /J4 -3-ketoszteroid és zf1,4 -3-ketoszíteroid koncentrációját meghatározzuk és a. meghatározás alapján minimális zl4 -3-ketoszteroid, ill. minimális zT^-S-ketoszteroid és maximális -z!1» 4 -3-ketoszteroid koncentráció elérésekor a mikrobiológiai dehidrogénezés folyamatát leállítjuk. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás kiviteli módja a zi4 -3-ketoszteroid tartalom meghatározására» melyre jellemző, hogy a tioszemikarbaziddal történő reagáltatást 0 C° körüli hőmérsékleten 30 perc körüli időtartammal végezzük, a reakciót puffer adagolásával- a pH felemelésével megszakítjuk és a ZÍ4 -3-ketoszteroid koncentrációt A = = 302 + 5 m/x hullámhosszon történő extinkeió mérés alapján standard görbével összevetve állapítjuk meg.
