150099. lajstromszámú szabadalom • Eljárás prednozolon előállítására
150.099 le S-vegyület átalakítása hidrokortizonná Absidia orchidis tenj^észetével, majd a szűrt fermentlé hidrokortizon tartalmának közvetlen átalakítása prednizolonná Corynebacterium simplex tenyészetével. Tekintve, hogy az első átalakításban a hidrokortizon mellett egyéb szteroidok is keletkeznek, a szokványos kémiai analitikai módszerekkel kellő gyorsasággal nem határozható meg pontosan sem a fermentlé kiinduló hidrokortizon tartalma,, sem annak csökkenése a következő átalakítás során és ennék folytán az azidőpont sem, amikor az optimális átalakítás elérésekor a -folyamatot le kell állítani nehogy a hasznos prednizolon tartalom oxidatív lebontást szenvedjen. Ilyenformán az előbbiekben vázolt kettős fermenta'tív átalakítás a szokványos módszerekkel optimálisan nem vitelezhető ki. Ezzel szemben ilyen esetben eljárásunk szerint dolgozva a prednizolon átalakítás optimális szinten stabilizálódik, lebontás nem következik be és az átalakítás megszakításának időpontja a hosszabb időn keresztül állandó prednizolon szint alapján megállapítható. Külön jelentős előny az, hogy a káros enzimek kialakulásának meggátlása folytán a folyamat nemcsak egyetlen éles időpontban álltható le optimális nyeredékkel, hanem megfelelő idő áll rendelkezésre a prednizolon szint meghatározásának pontos kivitelezésére és ennek alapján a folyamat leállítására. ' Eljárásunk szerint Reichstein-féle S-vegyület a hidrokortizon izolálása nélkül, közvetlenül kiváló termeléssel alakítható át prednizolonná, amennyiben a Reichstein-féle S-vegyület et Absidia orchidis tenyészetéhez adagolunk, az átalakítás megtörténte után szűrünk s a kapott fermentlé hidrokortizon tartalmát a 17-es szénatomon oldalláncot nem tartalmazó szteroidokhoz, például /f-androszténdionhoz adaptáltatott Corynebacterium simplex tenyészetével a fehérjeszintézist gátló anyagok, például kloramfenikol jelenlétében prednizolonná alakítjuk át. Találmányunk eljárás prednizolon előállítására hidrokortizonból oly módon, ; hogy a. /P-kettőskötés kialakítását mikrobiológiai úton, Corynebacterium simplex species 17-es szénatomon oldalláncot nem • tartalmazó szteroidhoz előzetesen adaptáltatott tenyészetével, a fehérjeszintézist gátló anyagok jelenlétében végezzük. Eljárásunk egyik előnyös kiviteli változata szerint szubsztrátumként hidrokortizon. helyet Reichstein-féle S-vegyületből Absidia orchidis species tenyészetével nyert, szűrt, hidrokortizont tartalmazó fermentlevet alkalmazunk. A 17-es szénatomon oldalláncot nem tartalmazó szteroidként előnyösen zT-androsztendiont használunk. A fehérjeszintézist " gátló anyagként célszerűen" kloramfenikolt alkalmazunk. Eljárásunk kivitelezését, valamint az elvégzett ellenőrző kísérletek eredményeit az alábbi példák szemléltetik: 1. példa' ' Corynebacterium simplex kétnapos • burgonyás f erdeagar . tenyészetéről 5 ml desztillált vízzel szuszpenziót készítettünk és ezzel oltottuk be 10Ű ml CSS jelű. táptalajt (CS 5 tán 4.4 g KH,P04 , 8,8 g Na 2 HP0 4 -7H 2 0, 20 g élesztő-kivonat szárazanyag 1 literre feli. 500 ml-es Erlenmeyer lombikban. A lomb;; előzetesen 120 C°-on 25 percig sterilizáltuk. .. oltott tenyészeteket 28 CD -os termosztát szob 200-as fordulatszámú rázóasztalon inkubáiru óra hoszat. ,3 db ilyen rázott tenyészettel tunk 5 liter KA12-es táptalajt 10 literes ,; palackban (KA12-es táptalaj:- 5. g aszparacin KH2P0 4 , 25 g techn. glükóz, 2 g .sörélesztők; szárazanyag, 20 g nedves kukoricalekvár 5 csapvízben, a pH-t sterilezés előtt 6,7-re á tuk. Sterilezés 121 CD -on 30 percig). A be fermentort .24 órán át inkubáltuk 37 C"-on cenkénti 300-as fordulatszámmal keverten percenként 5 liter steril levegőt fúvatva át nyészeten. Ebből a tenyészetből 166—166 mértünk ki 500 ml-es steril Erlenmeyer L kokba. .Az 1. és 2. lombikhoz 16,6 mg _1J -an: téndiont adagoltunk 1,66 ml aceonban old1 24 órán át 28 Cc -on, rázóasztalon inkubálít 3. lombikhoz 16,6 mg hidrokortizont adage 1,66 ml acetonban oldva és ugyanilyen kőinyék között, inkubáltuk. Az így adaptáltato nyészeteket 3 db. 5—5 liter. 2 g hidrokor tartalmazó steril-vizes fermentorhoz adagolt' az 1. fermentorhoz 0,5 g kloramfenikolt is 1 mértünk. Az inkubációs körülmények azo voltak a fermentoros tenyésztésnél alkain körülményekkel. A keletkezett prednizolon r nyiségét kénsavas kromogénképzés alapján pítottuk meg: 0,480-as extinkció felelt m; mg/100 ml prednizolon tartalomnak. Az en nyéket az -1. táblázat, szemlélteti. 1. táblázat órákban adagolás után - § 2« ~ c-i n 0 80 70 50 4 520 520 440 6 680 • 640 ./ 640 8 760 760 740 10 820 -760 760 12 820 — 700 14 . 800 820 660 16 820 720 600 18 820 540 420 20 780 440 260 22 800 300 160 24 860 180 80 Az 1. táblázat bizonyítja, hogy a zf-andre dión is kiváltja a ZP-dehidrogenáz enzim : zisét. Az így adaptált tenyészetet összehozv rokortizohnal, az a hidrokortizont oxidálja nizolonná, de a keletkezett predmzolont vább bontja, mert az oxidációs periódus kialakulnak a prednizolont leépítő adaptív mek is (2. fermentor). Az 1. fermentorban
