149771. lajstromszámú szabadalom • Eljárás C-cephalosporin kinyerésére

4 149.771 gyantáról lefolyó folyadéknak természetesen mentesnek kell lennie a C-cephalosporin tói. Az oszlopot ezután desztillált vízzel mossuk, percenként 0,1 ágy-térfogatnak megfelelő sebességgel, mindaddig, míg a lefolyó folyadék már nem adja a ninhidrin-reakciót. Ezután a mosást n. ecetsavolda.ttal folytatjuk, amely egy ninhidrinreakciót adó, C-cephalosporint azonban nem tartalmazó pigmentált sávot mos le az oszlopról. Ez a sáv erős ibolyántúli abszorpciót is mutat 260 miliimikronnál; a mosást rendszerint addig folytatjuk, míg az abszorpció értéke nem csökken E = 8 alá (1 cm-es cellában). Ezután az eluálást oly n ecetsavoldattal folytatjuk, amelynek pH-értékét piridin hozzáadásával 5,5-re állítottuk be. Ezt az oldatot felhasználás előtt célszerű 0 C° hőmérsékletre lehűteni és az eluátum frakcióit is a lehetőséghez képest alacsony hőmérsékleten tartani felfogásuk után. A. lefolyó folyadék pH-értéke 2,4-től állandóan növekszik 5,5-ig; amikor ezt az 5,5 pH-értéket elérjük, a mosás befejez-Jiető. A C-cephalosporin eluálása akkor kezdődik meg, amikor a lefolyó folyadék pH-értéke eléri már kb. a 4,0 értéket és teljesen befejezettnek tekinthető, amikor a pH-érték 5,2-re emelkedik. Az átfolyási sebesség célszerűen percenként 0.07 ágy-térfogatnak felel meg; a lefolyó folyadékot frakciókban fogjuk fel, egy-egy frakció mennyisége pl. 0,16 ágy-térfogatnak felelhet meg. Azt tapasztaltuk, hogy a C-cephalosporin jelenlétének ellenőrzésére a biológiai módszer a legmegbízhatóbb, bár alkalmazható erre a célra a ninhidrinreakció is. A biológiailag aktívnak talált frakciókat ezután egyesítjük és vákuum alatt, 25 C°-ot meg nem haladó hőmérsékleten szirupsűrűségűre pároljuk be. Célszerű a bepárolást minél alacsonyabb hőmérsékleten végezni, mert annál kisebb mértékben kell a C-cephalosporin bomlásával számolni. Célszerű ellenőrizni a bepárlás előtt, hogy kloridion nincs-e jelen a rendszerben, mert ennek az ionnak a jelenléte olyan alacsony pH-érték kialakulására vezethet, amelyen a C-cephalosporin bomlik; amellett a klorid-ionok jelenléte az el-járás további szakaszában, az acetonos lecsapást is gátolja. Ha klorid-ionok jelenlétét tapasztaljuk, ezeket oly módon távolítjuk el, hogy a klorid mennyiségét meghatározva, 0,95 egyenértéknek megfelelő mennyiségű ezüstacetát-oldatot adunk az oldathoz. A lecsapódott ezüstkloridot szűrés útján távolítjuk el. Ezután a szirupsűrűségű oldathoz a C-cephalosporin lecsapása céljából legalább 50 tf. absz. acetont adunk és a levált por alakú terméket az acetonban eldörzBÖljük. A por alakú terméket centrifugálással különítjük el' és abisz. acetonnal alaposan mossuk az ecetsav teljes eltávolítására. Ezután a C-cephalosporint szabad sav alakjában tartalmazó nyers terméket vákuum alatt megszárítjuk. A termék ebben az állapotban rendszerint kb. ' 1 E/mg aktivitást mutat. A kapott port kevés vízben oldjuk és pH-értékét, amely ebben az állapotban 3 körül van, nátriumhidroxid óvatos hozzáadása útján 5-re állítjuk be. Az így kapott nyers C-cephalosporin-nátriumsót olyan oszlopra visszük, amely finoman elosztott Amberlité IR—4B gyantát (amely ebben az állapotban XE—58 jelzéssel kerül forgalomba) tartalmaz acetát alakban. Ezután az anyagot kromatografáljuk híg piridinaeetát-oldattal történő lassú eluálás útján. Ezzel a C-cephalosporint részlegesen mentesítjük a szennyezésektől és könnyen, kristályosítható nátriumsóhoz jutunk. Az e célra felhasználásra kerülő, 150—200-as szitafkiomságú gyantát kb. 50 cm magasságú ' oszlopban alkalmazzuk, A szükséges gyanta-térfogat az eredeti kultúra-szüredéknek kb. 0,0055-szöröse. Az oszlopot célszerűen kb. 4 C°-ra hűtött helyiségben tartjuk és önműködő frakció-felfogót alkalmazunk a lefolyó folyadék frakcionálására. A mosófolyadékot (0,3 mólos eoeteavoldat, amelynek pH-értékét piridin hozzáadásával 5,0-ra állítottuk be) az oszlop tetején vezetjük be és átfolyási sebességét valamely erre alkalmas készülék segítségével szabályozzuk. Kísérleteink során állandó folyadékszintet fenntartó hidrosztatikus berendezést vagy perisztatikus szivattyút alkalmaztunk erre a célra, a jelenlegi nagyobb méretű üzemeltetés során, azonban azt tapasztaltuk, hogy a legmegbízhatóbb eredményeket oly módon érhetjük el, ha a mosófolyadékot egy zárt tartályban, tartjuk és ebben a tartályban a folyadékszint felett állandó nagyságú légnyomást tartunk fenn. A nyers C-cephalosporin-nátriumsó oldatát a gyantaoszlop tetején folyatjuk az oszlopba, majd ezt követően a készülék felső részét a mosófolyadékkal töltjük óvatosan fel és a folyadékáramot óránként kb. 0,1 ágy-térfogatnak megfelelő értékre szabályozzuk be. Az összegyűjtött frakciók mennyisége pl. 0,018 ágy-térfogatnak felelhet meg, azonban kívánt esetben ennél jóval nagyobb frakciókat is felfoghatunk. A C-cephalosporinnak a frakciókban való elhelyezkedését biológiai módszerrel vizsgáljuk; alkalmazható azonban erre a célra -a ninhidrinreakció is. A C-cephalosporin az oszlop működtetésének megkezdése után kb. 36—48 órával kezd megjelenni (a 80—160. frakciókban, egészen a 220. frakcióig, az általunk alkalmazott méretű frakciók esetébein). A hatóanyagot tartalmazó frakciókat egyesítjük és vákuum alatt, lehetőleg minél alacsonyabb hőmérsékleten szirupszerű sűrűségűre pároljuk be. A szirupszerű koncentrátumhoz legalább 98 tf. absz. acetont adunk a C-eepfialosporin lecsapása céljából. A kapott porszerű csapadékot absz. acetonnal többször mossuk, majd vákuum alatt megszárítjuk. A szabad sav alakjában kapott C-cephalosporin ebben az állapotban, kb. 5—6 E/mg aktivitást mutat, ami 50—60%-os tisztaságnak felel meg. A szabad, sav alakjában kapott C-cepbalosporin port kis mennyiségű vízben oldjuk; az oldat 3 körüli pH-értéket mutat. Nátriumhidroxid-oldatot adunk óvatosan, állandó keverés közben hozzá, míg a pH-érték 6,5-re nem növekszik. Minthogy az oldat ebben az állapotban még némi piridint vagy egyéb bázist tartalmazhat, célszerű azt egy Dowex 50 X 8 gyantával (nátrium alakban) töltött kisméretű oszlopon átvezetni. Az oszlopot ezután vízzel mossuk mindaddig, míg a lefolyó folyadék nem mutat már ninhidrin-reakciót. Az oldatot ezután vákuum alatt/lehetőleg minél alacsonyabb hőmérsékleten, Gzirupsűrűségűre pároljuk be. •