149538. lajstromszámú szabadalom • Eljárás cianokobalamin-monokarbonsav előállítására
2 149.538 A Bi2-vitaminnal antagonists hatású cianokobalaminmonokarbonsavat célszerűen akként nyerjük ki, hogy a fermentlevet, de előnyösen a fermentleből kapott Bi2-vitaminkoncentráturnot lúgos, előnyösen 7,5—8,5 pH-érték mellett vízzel •nem elegyedő szerves oldószerrel kivonatolva előbb a Bi2-vitami,nt távolítjuk el, majd a Bj2-vitamintól mentesített vizes oldatot megsavanyítjuk, előnyösen 2—4,5 pH-értékre és vízzel nem elegyedő szerves oldószerrel kivonatoljuk, e szerves kivonatból az antagoriista hatású eianokobalamin-monokarbonsavat pedig kinyerjük, célszerűen akként, hogy azt vízzel elegyedő szerves oldószer vizes elegyével oldjuk ki és az oldatból az antagonista hatású cíanokobalamin-rnonokarbonsavat elkülönítjük. A Bi2-vitamin kivonatolásához szerves oldószerként igen előnyösen használhatjuk fenol, krezol, vagy halogénezett íeiiolszármazék és apoláros oldószer, pl. alifás szénhidrogén vagy ezek halogénszármazékából képezett oldószerelegyet. Az antagonista cianokobalamin-monokarbonsav kivonatolására a Bi2-vitamintól mentesített vizes oldatból használhatjuk a í'entemlített oldószerelegyeket. E szerves oldószerből azután az antagonista faktort vízbe visszarázzuk, úgy mint az pl. a Bi2-vitamm tisztításánál ismeretes. így pl. poláros oldószereket adagolunk, mint acetont, metiletilketont, dietilétert, dioxánt, etilacetátot, butanolt, amikor is az antagonista cianokobalaminmcnokarbonsavat a vizes fázisba szorítjuk vissza. A vizes oldatból a B -, ^-vitaminnál ismert módon pl. szenes adszorbcióval, majd vizes etanolos el'uálással tisztítjuk, vagy pedig a vizes oldatból poláros oldószerekkel, mint pl. butanollal, benzilalkohollal kivonatoljuk, majd vízbe visszarázva tisztítjuk tovább. A tisztított vegyület vízből vörös színű vaskostűk alakjában jó lekristályosodik, vízben, etanolban oldódik, hő- és fényérzékenysége továbbá az ultraibolya abszorbciós spektruma azonos a Bi2-vitaminéval. Papírkromatográfiás vizsgálatnál vízzel telített szekundér butanollal 18 órán át futtatva Macherey—Nagel 214 papíron felszálló módszerrel' a Bi2-vitaminhoz viszonyított relatív Rí értéke 0,'5—0,6. Papír elektroforézis folyamán pH 6,8 foszfátpuííerben anódosan vándorol. B12-vitaminná savamid képző ágensek jelenlétében visszaalakítható. A Bl2-vitamin mesterséges hidrolízis termékeivel összehasonlítva egységes monokarbonsavnak bizonyul, szemben a mesterséges hidrolízis folyamán adódó 3 izomer monokarbonsavval. Ecetsavat tartalmazó, vízzel telített szekundér butanollal papíron kromatografálva egységes képet kapunk, nem úgy mint a Bj2-vitamin savas hidrolízisével nyert monokarbonsavval. Mikrobiológiai agárlemezes vizsgálatnál az E. coli 113—3-nál a Bi2-vitamin növekedést serkentő hatását ellensúlyozza. A gátlás kompetitív jellegű és akkor lép fel teljes gátlás, ha ez antagonista cianokobalamin-monokarbonsav úgy aránylik a B ^-vitaminhoz, mint 40 : 1, vagy az arány ennél nagyobb. Farmakológiai vizsgálatnál már igen kicsi adagban gátló hatást fejt ki a myeloid rendszerre, a keringő granulociták számát nagymértékben, 60— 80%-ban lecsökkenti, ugyanakkor a vér eg3?éb alakos elemeinek a számát nem változtatja. Az antagonista faktornak toxikus hatását nem észleltük, midőn a hatásos dózis 150-szeres mennyiségét alkalmaztuk. A szóbanlevő antagonista faktor bizonyos szolid daganatokra is enyhe gátló hatást fejt ki. Az antagonista faktort a Bi2-vitamintól nem csak oldószeres módszerrel, hanem anioncser élő gyanta segélyével is elválaszthatjuk. E célra használhatunk közepes vagy erős bázisú anioncserélőket, melyeket lúgos kezelés után, tehát OH-eiklusban alkalmazunk. Az anioncserélő gyantára az oldatot gyengén savanyú vagy semleges oldatban visszük fel. A megkötött antagonista faktort a gyantáról önmagában ismert módon savanyú, lúgos, vagy sós oldattal eluálhatjuk. Jobb eredményt érhetünk el, ha az eluálószer vízzel elegyedő poláros szerves oldószert, pl. acetont, etanolt vagy metanolt is tartalmaz járulékosan. Általában pH 2 és 9 érték között dolgozhatunk előnyösen. ** A semleges Bi2-vitamin mellől a gyengén savanyú antagonista faktort eletkrodialízissel is elválaszthatjuk. Ezt célszerűen akkor alkalmazzuk, ha már nagy tisztaságú készítményt kívánunk szétválasztani. Az elválasztás semleges, vagy gyengén lúgos pufferben történhet. A cianokobalamin monokarbonsavat nem csak a PBS 77 jelzésű törzzsel végzett fermentleből ill. az abból kapott Bi2-vitamin koncentrátumból nyerhetjük ki, hanem egyéb Propionibacterium törzzsel végzett fermentálással kapcsolatban is, mert kísérleteink szerint a fermentálások során mindig képződik a szóbanlevő antagonista faktor. (Lásd 5. példa.) A találmány szerinti eljárást részletesebben az alábbi példák kapcsán ismertetjük: 1. példa: 50 literes üveglombikban 40 liter következő összetételű táptalajt sterilizálunk: 2% kukoricalekvár (szárazanyagra számítva), 2% glukóz, 1% CaCOs, 5 gamma/ml C0'(NO3 ) 2 , 1 gamma/ml 5,6--dimetilbenzimidazol. A táptalajt beoltjuk 10% azonos összetételű táptalajon tenyésztett PBS 77 jelű Propionibacterium shermanii törzzsel beoltott oltóanyaggal. 6 napig 28—29 C°-on tartjuk, naponta kétszer megkeverjük. 6 nap után összesen 150 mg Bi2-vitamint tartalmaz a fermentlé. A fermentálás befejezése után a baktériumokat centrifugálással elkülönítjük. A baktérium szuszpenziót 0,1% NaCN tartalmú 500 ml 70%-os vizes etanoUal 1 órán át főzzük, majd szűrjük. Az etanolos kifőzést még kétszer 200 ml-ei megismételjük. Az összegyűjtött vörös színű kivonatokat vákuumban eíanolmentesre pároljuk. A tömény vizes oldathoz 5 g aktív szenet adunk, 1/ 2 óra állás után nuccsoljuk, kevés vízzel átmossuk a szenet, majd 60—70 C°-os 67%-os vizes etanoUal eluáljuk. Az eluátumot vákuumban etanolmeníesítjük. A vizes oldatot 10%-os ammóniával pH 8-ra lúgosítjuk és fenol-széntetraklorid 1 : 3 elegygyel kivonatoljuk mindaddig, míg a fenolos fázis már alig rózisaszínű. Ezután a vizes részt HCl-el pH 3,5-re savanyítjuk és folytatjuk a fenol széntetrakloridos kivonatolást mindaddig, míg ez oldószer már alig rózsaszínű. A savanyítás után kapott
