149286. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az Aujeszky-féle vírus csökkentett virulenciájú, immunizáló képességű vírusvariánsának és ebből készült oltóanyag előállítására
2 149.286 valamint a szövettenyészetekben történő közbenső szaporítást addig ismételjük, míg a szélesztés során kizárólag kis telepeket kapunk, melyek immunízáló képességgel rendelkező ,,K" vírusvariánsból állanak, melyek sertés- és. borjúvese hámsejttenyészetek szineiciiimot nem képeznek, csupán a sejtek izolált lekerekodését hozzák létre. A ,,K" vírusva.riáns szelekciójára célszerűen olyan vírust használunk,, melyet előzőleg 25 és • 40 C° közötti, előnyösen 23—32 C° hőmérsékleten, 20—30 passzázson keresztül szaporítottunk. A „K" vírusvariánst emlősök vesehámsejtjei, vagy csirkeembrió szövetten vészeién szaporítva vaeeinának dolgozhatjuk fel. A ,,K" típusú vírusvariáns előállítására alkalmas eljárás kivitelére az alábbi példákat adom meg: 1. példa: Aujeszky-féle virulens vírust, kémcsőben előállított és 100%-ban benőtt egyrétegű sertésvesehámsejt-tenyészetekre oltjuk, amelyeket 28—32°os termosztátban tartunk addig, míg a sejtek teljesen le- nem kerekednek. A vírust ezután még 30-szor oltjuk át ilyen viszonyok között tartott tenyészetekre. Ezután a víruspopulációból a ,,K" típusú vírusvariáns szelekciója céljából a vírustartalmú tápfolyadékot 1 : 10 lépték szerint hígítjuk és ebből 1—1 ml-t 4—5 napos, 100%-osan benőtt, 6—9 cm átmérőjű Petri-esészében készített sertés'vesehámsejt-tenyészetre visszük, amelyet 1 óráig 37°-os termosztátban tartunk. Ezután a sízövettényészeteket 10 ml Hanks-féle oldattal leöblítjük, majd a szövettenyészeteket Dulbeeco módszere szerint fedőagarral lefedjük és 37°-os termosztátba helyezzük. 3—4 nap múlva azt észleljük, hogy a magasabb •hígításokban az ép szövetek között egymással nem érintkező tarfoltok találhatók, így pl. 10~7 hígításban 2, a TO -6 hígításban 31, a 10~5 hígításban pedig 193 tarfolt látható. Vírus iziolálására legcélszerűbb ebben az esetben 10~6 hígítású vírussal oltott szövettenyészeteket felhasználni. A 31 tarfolt közül 29-inek az átmérője átlagosan 3 mm, 2-nek az átmérője pedig 2 mm. Ez utóbbiakból sertésvesehám-sejttenyészetekre kioltunk, majd háromnapi inkubálás után újabb szélesztési eljárásnak vetjük alá, és ezt addig folytatjuk, amíg a plakk-eljárassal csak kis átmérőjű telepeket kapunk. Az ilyen telepből kioltott vírus az egyrétegű vesehámsejttenyészetekben a sejtek izolált lekerekedésében mutatkozó citopatogén hatást mutat. Fontos, hogy a plakk-módszer szerint végzett izoláláskor a fedőagar, valamint a citopatogén hatás ellenőrzésére szolgáló szövettenyészetek tápfolyadékának pH-ja 6,8—7,0 között legyen, mert ha ennél lúgosabb, a „K" és ,,N" típusok tarfoltjai és citopatogén hatása között nem jelentkezik különbség és ezért nem. tudjuk szelektálni a két variánst. Abban az esetben, ha az izolált variáns következetesein kis tar foltokat okoz és a hámsejtek izolált lekerekedésében mutatkozó citopatogén hatással rendelkezik, a variáns „K" jellege áHandósultnak tekinthető. A virulenciájának ellenőrzésére 2 kgosnál súlyosabb nyulakat kell használni; az ilyen nyulak '0—50%-ának a „K" variánssal történt intramuszkuláris fertőzés után életben kel] maradniuk. Előfordulhat, hogy a virulens vírust a fenti módon kezelve a kisebb tarfoltos „K" variáns nem jelenik meg. Ebben az esetben [máshonnan vett virulens vírustörzshői kíséreljük meg a „ív" víriisvariáns elkülönítését. Az oltóanyagtermelési eljárás kivitelére a következő példát adom meg: 2. példa: A vírus „K" típusú variánsát sertés vagy bármilyen emlős veséjének egyrétegű sejttenyeszeiéiben, vagy csirkeembrióból származó sejteknek tenyészeteiben szaporítjuk el. Fontos, hogy nagytömegű sejt álljon rendelkezésre, ezért a sejttenyészeteket legcélszerűbb 250, 500 vagy 2000 ml-es, jó minőségű üvegből készült Kolle- vagy Roux-féle üvegekben elkészíteni. A szövettenyészeteket a szokásos 'módszerek és táptalaj felhasználásával készíthetjük. Jobbnak találtam azonban az alábbi módon készített tápfolyadékot, mely 10—15% súlyrész szarvasmarhasavót és 0,25—0,5% súlyrész hidrolizált laktalbumint és 85—90% olyan Hanks-féle oldatot tartalmaz, melyben a NaHCOn szokásos 0,35 g-nyi mennyiségét 1,0 g-ra növeltük. E tápfolyadékot + 10 C°-ra hűtjük és abban annyi széndioxidgázt nye-1 etünk el, amennyit az 10 percig tartó, állandó átbugyborékoltatás után, állandó rázás közben elnyelni képes, amikor is a pH 6,8 alá csökken. Az ilyen tápfolyadékban szuszpendált sejtszuszpenziót a tenyésztésre szánt üvegedénybe olyan mennyiségben mérjük be, hogy annak fenekét 2—3 mm vastagságban ellepje. Ezután az üvegedénybe a levegőt 5% térfogat mennyiségű CO2 gázzal keverjük és az edényt légmentesen lezárva termosztátba helyezzük. 4 nap múlva 95—100%-os benőttsé'get tapasztalunk, majd a tápfolyadékot kicseréljük pl. szarvasmarha allantois folyadékkal. Ezután a szövettenyésizeteket 0,1—0,1 ml vírussal kell fertőzni. A vírus legmagasabb ti terét akkor éri el, amikor a sejtek 90—95%-a lekerekedik. Ekkor a vírustiter 10~7 —HT 8 . Ez a vírus liofilizált állapotban hónapokig, + 4°-on tarj/va pedig 10 napig oltóanyagként felhasználható. / Szabadalmi igénypontok: 1. Eljárás az Aujeszky-féle vírus; csökkentett virulenciájú, immunízáló képességű vírusvariánsának előállítására szövettenyészetek felhasználásával, melyre jellemző, hogy a vírust emlősök sejttenyészetén, különösen sertés veseháimsejt-tenyészetén, Dulbecco-féle plakk-módszerrel szélesztjük, mely módszernél a fedőközeg előnyösen agar, mely fedőközeg pH-ját 6,8—7,0 értékre állítjuk be, majd e szélesztés során kapott telepekből a kisebb telepeket kiválasztjuk és azok vírusát szövettenyészetben elszaporítva a szélesztést a Dulbecco-féle módszerrel újból megismételjük és e szélesztést, valamint a szövettenyészetekben való közbenső szaporítást addig ismételjük, míg a szélesztés során kizárólag kis telepeket kapunk, melyek immunízáló képességgel rendelkező „K". (Az Országos Közegészségügyi Intézetnél 601 121 1 sz. alatt I960, nov. 21-én letétbehelyezett) vírus-
